Идентификация рецепторов поверхности клетки используя Геном-Шкала CRISPR/Cas9 Генетические экраны

Обнаружение взаимодействий поверхности клеток с использованием имеющихся в настоящее время биохимических подходов по-прежнему создает технические проблемы. Этот протокол предоставляет генетическую альтернативу, используя подход к скринингу клеток масштаба генома для выявления взаимодействий рецепторов лиганда на поверхности клетки. В отличие от большинства других существующих методов, этот метод не делает никаких предположений относительно биологии рецепторов.

Это дает возможность определить взаимодействия при посредничестве широкого спектра молекул поверхности клеток. Молекулы поверхности клеток непосредственно доступны для таких препаратов, как моноклональные антитела. Таким образом, определение взаимодействий при посредничестве этих молекул может иметь важные терапевтические последствия.

Этот метод, как правило, применим к исследователям, заинтересованным в изучении клеточных процессов сигнализации и распознавания в широком диапазоне биологических контекстов, включая нейронные и иммунологические взаимодействия, а также взаимодействия патогенов-хозяина. Протокол требует высокой пропускной способности машины сортировки ячеей и следующего поколения секвенирования машин. Убедитесь, что эти средства доступны перед запуском протокола.

Начните с восьми серийных разбавления образцов биотинилированного белка в пластине 96-колодец, гарантируя, что окончательный объем каждого разбавления составляет не менее 200 микролитров и что только тег управления включен. Сделайте дубликат пластины образцов, удалив 100 микролитров из каждой хорошо и передачи его в новую пластину 96-хорошо. Включите только теги управления белком, который будет использоваться в качестве контрольного зонда во всех обязательных эссе.

Добавьте 100 микролитров по 0,1 микрограмма на миллилитр стрептавидина-PE к скважинам в одной из пластин и 100 микролитров буфера разбавления к скважинам другой пластины. Инкубировать пластину в течение 20 минут при комнатной температуре. Между тем, блокировать скважины стрептавидина закодированной пластины с буфером разбавления в течение 15 минут.

После мытья тарелки убедитесь, что она сухая. Затем перенесите общий объем образца с обеих пластин на отдельные скважины стрептавидиновой кодовой пластины и инкубировать его в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации, мыть пластину три раза с 200 микролитров мыть буфера.

Добавьте 100 микролитров мыши анти-крысы Cd4d3'4 IgG и инкубировать пластину еще на час. Повторите стирку. Добавьте 100 микролитров противомошачьей щелочной фосфатазы и оставьте тарелку при комнатной температуре на час.

Затем мыть скважины три раза с мыть буфера и один раз с разбавления буфера. Подготовка р-нитрофенил фосфат на один миллиграмм на миллилитр в краситель этаноламин буфера и добавить 100 микролитров к каждой хорошо. После 15-минутной инкубации, измерить поглощение имеют каждый хорошо на 405 нанометров.

Используйте минимальное разбавление, при котором нет сигнала на пластине, в качестве соответствующего фактора разбавления для создания тетраперов. Инкубировать стрептавидин-PE и соответствующее биотинилированное разбавление белка в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем храните конъюгированные белки в легкой защищенной трубке при четырех градусах Цельсия до дальнейшего использования.

Спин конические трубки с обработанными и контроль образцов в 200 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и заморозить одну из труб при температуре минус 20 градусов по Цельсию для более длительного использования. Повторно приостановить гранулы в другой трубке в 10 миллилитров PBS с 1%BSA и выделить 100 микролитров клеток в качестве отрицательного контроля на 96-хорошо пластины.

Затем докодированный рекомбинантный белок добавить к клеточной суспензии в конической трубке и в пластине 96-колодец. Выполните окрашивание клеток в течение по крайней мере одного часа при четырех градусах по Цельсию на роторе скамейки с нежным вращением. Затем гранулы клетки в 200 раз G в течение пяти минут и удалить супернатант.

После мытья клеток дважды, повторно приостановить их в пять миллилитров PBS. Процедить клетки через 30 микрометровый ситечко, чтобы удалить клеточные кластеры. Затем проанализируйте их с потоком Содор.

Используйте отрицательный контрольный образец для выхода на посадку для положительных и PE отрицательных ячеек BFP. Затем сортировать образец и собирать от 500 000 до 1 миллиона BFP положительных и PE отрицательных клеток в 1,5 миллилитров центрифугации трубки. Больная клетка будет зависеть от связывания клеток с белком, но обычно собираются от одного до 5% отрицательных образцов PE.

Теперь пусть отсортированные клетки путем центрифугирования в течение 500 раз G в течение пяти минут, а затем тщательно удалить супернатант. Гранулы могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение шести месяцев. Используйте функцию подсчета магии для карты последовательностей от несортированной и отсортированной популяции до справочной библиотеки, которая даст необработанный файл подсчета.

Вы запустите тестовую функцию магии, используя необработанные подсчеты из несортированного образца управления в качестве контроля и подсчеты из отсортированного образца в качестве лечения. Откройте сгенерированный файл резюме генов и ранжировать столбец ранга паузы в порядке возрастания. Затем определите попадания с ложной скоростью обнаружения менее 0,05 пункта.

Рецептор, как правило, занимает очень часто в первой позиции. Наконец, используйте R или эквивалентное программное обеспечение для построения надежного рейтинга алгоритм оценка для положительного выбора. В клетках NCI-SNU-1 и HEC-293 соответственно были выполнены экраны нокдауна генома для идентификации связующего партнера человека TNFSF9 и P falciparum Rh5.

Связывание поведения Rh5 было затронуто как гепараном сульфатом, так и известным рецептором BSG, в то время как TN-FRSF-9 не терял привязки к своему известному рецептору TN-FSF-9. При предварительной инкубации с растворимым гепарином. Распространение GNA в библиотеке миг-мутантов показало, что сложность библиотеки сохранялась на протяжении всего эксперимента.

Техническое качество экранов оценивалось путем изучения распределения наблюдаемых складных изменений G-РНК, ориентированных на набор несуществующих генов, по сравнению с распределением для эталонного набора основных генов. Кроме того, обогащение на уровне путей показало, что были выявлены и значительно обогащены ожидаемые основные пути отсева населения. При сравнении образца управления с исходной плазмидной библиотекой.

Надежный алгоритм ранга или RRA-оценка обеспечивает меру, из которых G-РНК последовательно ранжируются выше, чем ожидалось. На экране для TNFRSF9 лучшим хитом стал TNFSF9, который является известным связующим партнером. Кроме того, был также выявлен ряд генов, связанных с путем TP53.

В случае RH5, в дополнение к известному рецептору, и гену, необходимому для производства сульфатных приколов, был также идентифицирован ген SLC16A1. Подход к скринингу, как правило, очень надежный, и непосредственно взаимодействующий рецептор должен быть высоко оценен в списке генов, обогащенных в этом порядке популяции. Очень важно проверить хиты, полученные с экрана.

Если взаимодействие опосредовано белками, биохимические подходы, предназначенные для изучения бинарных белковых белковых взаимодействий, например, могут быть использованы для дальнейших исследований проверки. Из-за беспристрастной природы масштаба генома этого подхода, мы ожидаем, что он поможет в изучении взаимодействий при посредничестве трудно изучать молекулы клеток, таких как липиды, мультипасс мембранных белков и гликанов. Он также может выявить новые пути, необходимые для торговли рецепторами и биологии.