Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение
10 марта 2020 г.
Анализ потопа саженцев облегчает быстрый скрининг диких томатов на устойчивость к бактерии Pseudomonas шприцев. Этот опрос, используемый в сочетании с рассеиванием бактериального роста, может помочь в дальнейшей характеристике основной резистентности к бактерии, и может быть использован для отображения данных для определения генетической основы резистентности.
Этот протокол высокой пропускной способности позволяет быстро скрининг саженцев помидоров от диких присоединений к бактериальному патогену Pseudomonas syringae. Анализ посевных наводнений сводит к минимуму время роста растений и потребности камеры роста, позволяет быстро оборот растений, и позволяет большие размеры выборки, которые будут проверены. Этот анализ является мощным инструментом, который может быть использован для проверки на устойчивость в диких присоединений и других линий со сложным генетическим фоном.
Протокол содержит конкретные направления для наводнений innoculation двух Pseudomonas syringae штаммов. Тем не менее, он является универсальным и может быть изменен для обнаружения устойчивости хозяина к другим бактериальным патогенам. Демонстрацией процедуры будет Яна Хасан, специалист по исследованиям в моей лаборатории.
Начните с выращивания саженцев помидоров. Поместите семена помидоров в 2,2 миллилитра микроцентрифуг трубки и добавить два миллилитров 50%отбеливатель раствора. Рок трубки в течение 25 минут, а затем удалить отбеливатель раствор с пипеткой.
Добавить два миллилитров ультра чистой воды и мыть семена, инвертирование трубки пять раз. Аспирировать жидкость из трубки, и повторить мыть еще четыре раза. После окончательной стирки добавьте два миллилитров ультра-чистой воды и вылейте семена в стерильную чашку Петри.
Стерилизовать миппы, пламяя их в этаноле затем использовать их для передачи от пяти до семи семян на 100 на 25 миллилитров пластины с 0,5 XMS плюс 0,8 процента агар-медиа. Запечатать края пластины хирургической лентой. Убедитесь, что пластины укладываются плоскими и лицом вверх.
Стратифицировать стерилизованные семена при четырех градусах по Цельсию в темноте, по крайней мере три дня, чтобы синхронизировать прорастание. Через три дня вертикально ориентируйте пластины так, чтобы корни росли вдоль поверхности пластины и линия семян ориентировалась горизонтально. Перенесите семена в камеру роста, установленную до 22 градусов по Цельсию с 16-часовым светом, 8-часовым темным циклом.
Выращивать саженцы в течение десяти дней в камере, после чего они, как правило, отображаются полностью появились и расширены cotyledons и возникающих первых истинных листьев. Полоса свежих бактерий на соответствующие КБ агар с плоской, стерильной зубочисткой. Для PstT1, инкубировать пластины при 28 градусов по Цельсию в течение 48 часов до использования бактерий в эксперименте наводнения.
Для подготовки инокулума, асептически resuspend бактерий в стерильных, десять миллимолярд хлорида магния к оптической плотности 0,1. Затем сделайте два серийных разбавления, чтобы получить рабочую концентрацию с OD600 из 0075. Также подготовить от одного до десяти разбавления неионных органосиликон серфактант кополимер в десять миллимолярд хлорида магния.
Vortex его и добавить его к бактериям, закрученного трубки для смешивания. Перенесите пластины с десятидневной рассадой из камеры роста в шкаф биобезопасности и удалите хирургическую ленту. Затем перенесите по шесть миллилитров инокулума на каждую тарелку.
Аккуратно нажмите саженцы в инокулум с кончиком пипетки и начать таймер в течение трех минут. Держите одну тарелку в каждой руке и наклоните переднюю часть пластины вниз, чтобы погрузить котилендоны и листья саженцев. Swish инокулум сторону в сторону пять-семь раз, а затем наконечник пластин обратно, чтобы покрыть корни с инокулем.
Наклоните пластины снова и повторите цикл в общей сложности три минуты. Налейте инокулум с тарелок, установите их на плоскую поверхность, и слить любой остаточный инокулум во второй раз. Переверните пластины и поместите их обратно в камеру роста.
Moneymaker-PtoR и Moneymaker-PtoS сорта были затоплены PSTDC3000 и фенотипированы через семь-десять дней после наводнения. Саженцы Moneymaker-PtoR несут генный кластер PtoPRF и устойчивы к PSTDC3000. В то время как почти изогенные саженцы Moneymaker-PtoS, которые не могут распознать эффекторы PSTDC3000 AVRPto или AVRPto-B, быстро погибли в течение семи дней после наводнения.
Десятидневные саженцы были затоплены PstT1 и фенотипированы по крайней мере через десять дней после наводнения. Восприимчивые присоединения были мертвы, имели коричневые апические меристемы и не хватало нового роста. В отличие от этого, устойчивые саженцы показали высокий уровень нового зеленого роста и пережили инфекцию PstT1.
Анализы роста бактерий были проведены для количественного подтверждения сопротивления PstT1 и Solanum NeoRici LA1329. Существовал 1,7 журнала разница в росте бактерий между устойчивыми и восприимчивыми LA1329 и 1,6 разница журнала между устойчивыми LA1329 и Moneymaker-PtoS, который коррелирует с фенотипическими результатами. При выполнении этого анализа, наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы обратить пристальное внимание на асептические техники на протяжении всего протокола и обеспечить, чтобы все саженцы на тарелке тщательно затоплены.
Обязательно автоклав инфицированных тканей растений и бактерий и распоряжаться материалами в соответствии с соответствующими правилами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод затопления проростков позволяет проводить быстрый скрининг образцов дикого томата на устойчивость к бактерии Pseudomonas syringae. Этот высокопроизводительный протокол минимизирует время роста растений и позволяет эффективно тестировать большие выборки образцов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фитопатология
- Генетика
- Микробиология
Теоретические основы
- Метод анализа при затоплении проростков предназначен для скрининга проростков томатов.
- Pseudomonas syringae является значимым бактериальным патогеном, поражающим томаты.
- Данный анализ может быть адаптирован для других бактериальных патогенов.
- Он позволяет выявлять генетическую устойчивость у диких образцов томатов.
Цель исследования
- Провести скрининг образцов дикого томата на устойчивость к Pseudomonas syringae.
- Охарактеризовать генетическую основу устойчивости в картирующих популяциях.
- Предоставить высокопроизводительный метод для тестирования больших выборок образцов.
Используемые методы
- Метод инокуляции проростков томата штаммами Pseudomonas syringae путем залива.
- Оценка бактериального роста в проростках.
- Сравнение уровней устойчивости различных образцов.
- Использование условий климатической камеры для оптимизации роста растений.
Основные результаты
- Метод анализа эффективно выявляет устойчивые образцы томата.
- Он обеспечивает высокую скорость обработки и возможность тестирования больших выборок.
- Продемонстрирована универсальность в обнаружении устойчивости к различным бактериальным патогенам.
- Метод способствует дальнейшему генетическому анализу признаков устойчивости.
Выводы
- Метод анализа проростков при затоплении является эффективным инструментом для скрининга устойчивости томатов.
- Он может быть адаптирован для более широкого применения в патологии растений.
- Данный метод повышает эффективность скрининга устойчивости в исследовательских работах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Быстрая идентификация устойчивости патогенов в растительных системах способствует валидации мишеней на ранних этапах разработки агрохимикатов и биопестицидов. Метод анализа прорастков путем затопления позволяет проводить высокопроизводительный фенотипический скрининг дикого гермоплазматического материала, ускоряя поиск признаков устойчивости, имеющих прогностическую ценность для разработки средств защиты сельскохозяйственных культур. Данный подход снижает биологические риски за счет функциональной валидации механизмов устойчивости до проведения ресурсозатратных полевых испытаний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование механизмов взаимодействия патогена с хозяином для выяснения путей обеспечения устойчивости у томатов.
- Практическая ценность: Обеспечение функциональной валидации генетических локусов с использованием дискретных фенотипов выживаемости или количественных показателей роста.
- Прогностическая ценность: Обоснование приоритетности кандидатов на устойчивость путем корреляции фенотипических результатов с анализами бактериального роста.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет формировать воспроизводимые фенотипы устойчивости у 10-дневных проростков, что делает возможной крупномасштабную оценку гермоплазмы.
- Практическая ценность: Стандартизирует процедуры инокуляции и затопления для обеспечения однородного воздействия патогена на все образцы.
- Масштабируемость: Сокращает время выращивания и площадь использования климатической камеры, что позволяет ускорить оборачиваемость и проводить тестирование разнообразных образцов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Практическая ценность: Связывает фенотипы устойчивости проростков с результатами в полевых условиях посредством корреляции с данными о пролиферации бактерий.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет отличить восприимчивость, вызванную эффекторами (например, распознавание AvrPto), от широкоспектральной устойчивости с использованием почти изогенных линий.
- Преклиническая преемственность: Обеспечивает масштабируемый первичный скрининг, который служит основой для последующего генетического картирования и валидации признаков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ вписывается в процесс поиска — от скрининга гермоплазмы до идентификации перспективных линий, позволяя на ранних этапах выявлять признаки устойчивости до проведения генетического картирования или полевых испытаний.
- Открывающая биология: Исследование влияния генотипа хозяина на выживаемость патогена и жизнеспособность проростков после контролируемого инокулирования путем затопления.
- Скрининг: Получение количественных (измерение нового прироста) и качественных (выживание/гибель) данных для оценки устойчивости.
- Аналитика: Обеспечение корреляции фенотипической устойчивости с различиями в росте бактерий (например, снижение на 1,6–1,7 log) для подтверждения результатов.
- Трансляционные исследования: Связь анализов проростков с валидацией генов устойчивости посредством сравнения почти изогенных линий.
- Применение в масштабах предприятия: Возможность адаптации к различным штаммам Pseudomonas syringae и другим бактериальным патогенам при минимальной модификации протокола.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем установления связи между фенотипами устойчивости и определенным генетическим фоном (например, наличием или отсутствием Pto/Prf).
- Практическая ценность: Повышает пропускную способность за счет сокращения цикла роста и стандартизации метода инокуляции путем заливания.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей работы с признаками устойчивости, обеспечивая раннее фенотипическое и количественное подтверждение.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию диких образцов с учетом рисков на основе подтвержденной степени устойчивости и генетической доступности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области асептической техники, обращения с патогенами и выращивания растений в контролируемых условиях.
- Необходимы бокс биологической безопасности, климатические камеры с точной настройкой циклов освещения и температуры, а также спектрофотометр для стандартизации инокулята.
- Для воспроизводимости результатов между отдельными экспериментами необходима межгрупповая стандартизация времени затопления, циклов наклона и объема инокулята.
- Адаптация к новым штаммам патогенов требует оптимизации бактериальной OD600 и концентрации поверхностно-активных веществ при сохранении жизнеспособности проростков.
- Точность фенотипической оценки зависит от соблюдения единообразных периодов инкубации после затопления и объективной оценки появления новых зеленых побегов.
