Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей

Этот метод полезен для обнаружения и совместной локализации нескольких биомаркеров в одной криозекции, включая маркеры, которые обычно не обнаруживаются в парафиновых секциях. Используя этот экспериментальный метод окрашивания, время окрашивания значительно сокращается, и метод может быть выполнен в любой лаборатории. Демонстрацией этого метода будет Динеш Джайшанкар.

Он является квалифицированным постдоком из лаборатории, а также иммунотерапией Оценки Core, менеджер объектов. При выборе антител для анализа рассмотрите наборы фильтров возбуждения и выбросов, доступные в полуавтоматической системе визуализации. И после тестирования различных комбинаций фторфора конъюгированных первичных антител, подготовить флюорофоры, которые будут использоваться так, что у вас есть минимальное спектральное перекрытие, как это предлагается в таблице.

Для мультиплексного окрашивания приготовьте коктейль из антител с совместимыми флюорофорами при предопределенных оптимальных заблуждениях и добавьте коктейль в секции ткани, представляющие интерес. Для одного маркера окрашивания, добавить первичные спряженные антитела только на слайде. Для всех окрашивания, включают контроль необлядных слайд, который проходит ту же процедуру окрашивания без добавления первичного конъюгированных антител.

После часовой инкубации при комнатной температуре, защищенной от света, мыть горки два раза с PBS в течение пяти минут за стирку. После второй стирки, счетчик пятно мультиплекс окрашенных слайдов с DAPI в течение семи минут при комнатной температуре защищены от света, а затем две пятиминутные моет в PBS. Чтобы создать спектральную библиотеку, установите мощность лампы многоспектральной системы визуализации на 100% и откройте программное обеспечение для работы с микроскопом.

Выберите Протокол редактирования и новый протокол. Введите имя протокола и выберите Fluorescence в режиме визуализации. Затем предоставьте название исследования и загрузите одиночные окрашенные слайды на сцену.

Нажмите Edit Exposure и используйте опции автофокусировки и автоматического экспозиции, чтобы отрегулировать время экспозиции и получить снимки для одного окрашенного слайда. После визуализации одиночных окрашенных слайдов сохраните протокол. А в программном обеспечении машинного обучения под вкладкой Библиотеки сборки загрузите каждое запятнанное изображение.

Выберите соответствующий этаж и нажмите Экстракт. Программное обеспечение будет автоматически извлекать флуоресцентный сигнал, выбранный в полу. Чтобы сохранить извлеченный цвет, нажмите Сохранить для хранения.

Может быть создана новая группа или извлеченный цвет может храниться в существующей группе. Для многоспектральной визуализации, как только спектральная библиотека была создана и проверена, отрегулируйте время фокусировки и экспозиции на мультиплексном окрашенном слайде, как это было продемонстрировано, и открывает отсканированные слайды для создания новой задачи. Предоставьте идентификатор слайда и выберите протокол.

В соответствии с задачей выберите сканирование всего слайда для выполнения целого сканирования слайда на мультиплексном окрашенном слайде. Во всем изображении сканирования слайдов выберите области, представляющие интерес для изображения. Эти области будут сканироваться с использованием ранее установленного времени экспозиции на мультиплексном слайде, который будет использоваться для спектрального несмешания и анализа.

В микроскопе операционного программного обеспечения, выберите приобрести MSI поля в соответствии с задачей, а затем нажмите Process Slide, чтобы приобрести области, представляющие интерес на 20x увеличение. После того, как регионы, представляющие интерес были приобретены, в программном обеспечении машинного обучения, нажмите файл и открыть под вкладку ручного анализа для загрузки мультиплекса окрашенных изображений. Выберите источник спектральной библиотеки и нажмите Select Floors, чтобы выбрать ранее сохраненную спектральную библиотеку.

Нажмите файл и откройте для загрузки незапачканного изображения. Затем нажмите значок маркера чернил autofluorescence и нарисуйте линию или область на неокрашенном слайде, чтобы определить аутофлюоресценцию внутри ткани. Затем под вкладкой «Маркеры и цвета редактирования» назначьте имена для каждого маркера и нажмите кнопку «Подготовьте все».

После проверки спектрально несмешанные изображения, в программном обеспечении машинного обучения, выберите цитоплазмы мембраны и маркер варианты из панели. И используя кнопку эллипсиса, выберите использовать этот сигнал, чтобы найти, чтобы настроить маркер для обнаружения либо ядра, цитоплазмы или мембраны. когда цитоплазмический или мембранный маркер выбран, выберите использование сигнала для оказания помощи в ядерном варианте расщепления.

Программное обеспечение будет автоматически обнаруживать и создавать отдельные маски для ядра, цитоплазмы и мембраны. Используйте представление патологии для определенного маркера и параметры конфигурации в программном обеспечении, чтобы настроить маски, и нажмите Сегмент Все для создания карты сегментации клеток. После сегментации клеток выберите маркеры для фенотипа положительных клеток.

Кроме того, выберите по крайней мере пять клеток, которые не окрашены выбранным маркером для фенотипа отрицательных клеток. Затем нажмите Train Classifier, чтобы обучить программное обеспечение автоматически обнаруживать все ячейки, окрашенные выбранными маркерами на изображении. Будет создана фенотипная карта.

Как показывают эти изображения, антитела, проверенные на цитометрию потока, могут быть использованы для визуализации окрашивания тканей с помощью жидкокристаллическое настраиваемый фильтр в полуавтоматической системе визуализации. Здесь можно наблюдать спектрально несмешанные изображения замороженных человеческих миндалин, который включает в себя маркировку В-клеток и размножающиеся клетки в фолликулярном зародышевом центре, а также меж фолликулярную Т-клеточную область. Вариант представления патологии позволяет визуализировать индивидуальный рисунок окрашивания для каждого маркера в пределах ткани, представляющих интерес, предполагая, что мультиплексный метод окрашивания и спектральная визуализация работают на замороженных тканях.

Как попродемонстрировано на замороженном участке опухоли мыши, многоспектральная визуализация также может быть использована для визуализации опухоли, проникающих в Т-клетки, и других линий миелоидных клеток, включая связанные с опухолью макрофаги. Сегментация клеток и фенотип карты, а также количество окрашенных клеток для каждого маркера проанализированы программное обеспечение может быть создана, демонстрируя, что программное обеспечение может быть использовано для количественной оценки многоспектрального окрашивания на замороженных тканях. Для кого-то нового 6to техника, важно, чтобы узнать особенности ваших флюорохромов, и подготовить качество библиотеки слайды для спектрального несмешивания с минимальным спектральным перекрытием.

Также важно выполнять титровацию антител. На наш взгляд, этот метод может предоставить прикроватную информацию об эффективности иммунотерапии рака и других терапевтических применений, особенно когда время имеет значение.