Влияние искусственных слезных формулировок на метаболическую активность эпителиальных клеток роговицы человека после воздействия высыхания

Цель данного протокола состоит в том, чтобы оценить в модели in vitro, могут ли препараты искусственной слезы защитить эпителиальные клетки роговицы человека от высыхания. Этот метод может быть использован для выявления препаратов сухого глаза, которые могут помочь в защите глаз у людей с симптомами сухого глаза. В этом анализе используется очень чувствительная мера обнаружения метаболической активности эпителиальных клеток роговицы.

В результате могут быть обнаружены небольшие изменения в здоровье клеток роговицы из-за высыхания. Сегодня процедуру продемонстрируют Париса Мирзапур, Ниджани Нагаарудкумаран и Аделина Суко. Начните с выращивания иммортализованных эпителиальных клеток роговицы человека в колбах, покрытых коллагеном, с 20 миллилитрами DMEM/F12, содержащими 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин/стрептомицин при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, меняя среду каждые два-три дня.

Как только клетки почти сливаются, удалите питательную среду для клеточных культур и добавьте от четырех до шести миллилитров среды для диссоциации клеток в каждую колбу. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока они не отделятся, периодически проверяя их под микроскопом. Добавьте от двух до шести миллилитров DMEM/F12 с 10% FBS в каждую колбу и переложите содержимое в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Центрифугируйте клетки при 450-500 перегрузках g в течение пяти минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость, и ресуспендируйте клетки в предварительно подогретых средах. Определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра, и рассчитайте объем, который содержит 100 000 клеток.

Добавьте среду в каждую лунку 48-луночного культурального планшета, покрытого коллагеном I, вместе с рассчитанным объемом клеток, следя за тем, чтобы конечный объем в каждой лунке составлял 0,5 миллилитра. Затем инкубируйте клетки в течение 24 часов. Для проведения контрольной процедуры извлеките питательные среды из лунок, и немедленно обработайте клетки 150 микролитрами тестовой формулы или раствором для контроля среды.

Затем инкубируйте клетки в течение 30 минут. Удалите исследуемый раствор из клеток, и добавьте 0,5 миллилитра 10% раствора метаболического красителя. Инкубируйте клетки еще четыре часа.

После инкубации удалите по 100 микролитров раствора красителя из каждой лунки, и переложите его в 96-луночный планшет. Используйте планшетный ридер для измерения флуоресценции каждой лунки, установив возбуждение на 540 нанометров и излучение на 590 нанометров. Чтобы выполнить процедуру восстановления, инкубируйте клетки с исследуемыми растворами или контрольными растворами, как описано выше.

Затем добавьте в каждую лунку по 0,5 миллилитра среды DMEM/F12. Инкубируйте клетки в течение 18 часов. Затем удалите среду, и проверьте на метаболическую активность.

Для выполнения контрольной процедуры необходимо удалить питательные среды из клеток в 48-луночном планшете и немедленно обработать их исследуемой формулой или раствором для контроля среды. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут. После инкубации извлеките исследуемые растворы из клеток и поместите их в камеру с температурой 37 градусов Цельсия и влажностью 45% на пять минут для высыхания.

Далее добавьте 0,5 миллилитра 10% раствора метаболического красителя, и инкубируйте клетки в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После инкубации перелейте по 100 микролитров раствора метаболического красителя из каждой лунки на 96-луночный планшет и измерьте флуоресценцию. Чтобы выполнить процедуру восстановления, повторите ранее описанный протокол и включите 18-часовую инкубацию средой DMEM/F12 после этапа высыхания.

Затем проведите статистический анализ данных, как описано в рукописи текста. Три препарата для лечения синдрома сухого глаза сравнивались с точки зрения их влияния на жизнеспособность эпителиальных клеток роговицы человека. Первый и второй растворы оказывали существенное влияние на метаболическую активность клеток до высыхания.

Клетки, подвергшиеся воздействию первого раствора, показали дополнительное снижение метаболической активности клеток после 18-часового восстановления, что означает, что они изначально были повреждены, и травма не была восстановлена. Для сравнения, третий раствор оказал лишь незначительное влияние на метаболическую активность эпителиальных клеток. При сравнении способности этих липидсодержащих препаратов для защиты клеток от сухого глаза было обнаружено, что первый и второй растворы не защищают клетки от стресса высыхания.

Третье решение, однако, обеспечивало некоторую защиту. При посеве клеток в пластины, покрытые коллагеном, убедитесь, что клеточная суспензия содержит клетки, которые равномерно перемешаны так, чтобы каждая лунка была засеяна равным количеством клеток. Третье решение продемонстрировало статистически значимое улучшение жизнеспособности клеток и защиты от стресса высыхания по сравнению с двумя другими липидсодержащими продуктами.

Возможно, что минеральное масло с фосфолипидами, наряду с HP-гуаром и пропиленгликолем, позволяют третьему раствору обеспечить гидратационную защиту клеток роговицы и уменьшить испарение при высыхании.