Изоляция и расширение нейросфер от постнатальных (P1'3) Мыши нейрогенных ниш

Анализ нейросферы является полезным методом in vitro для изучения присущих свойств нервных стволовых /прародителей клеток, включая пролиферацию, самообнажение и мультипотенцию как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Благодаря своей трехмерной структуре, этот метод является мощным инструментом для изучения взрослого нейрогенеза. Это также полезно для культивирования и получения более высоких урожаев нервных стволовых / прародителя клеток.

Этот анализ нейросферы может быть применен к изучению расстройств мозга, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона или рассеянный склероз. Нейросферы также могут быть получены из других областей мозга или систем, таких как жировой ткани или кишечника. Демонстрацией процедуры с Филипой Рибейро будет Рита Соареш, аспирантка моей группы.

Чтобы собрать послеродовой день от одного до трех мозгов мыши, удерживайте вентралую часть тела у основания головы и используйте небольшие заостренные ножницы, чтобы сделать разрез средней линии кожи по всей длине головы, чтобы разоблачить череп. Сделайте продольный разрез у основания черепа и продолжайте резать вдоль сагиттального шва под мелким углом, чтобы избежать повреждения структур мозга. Используйте изогнутые типсы, чтобы очистить череп в стороны, чтобы разоблачить мозг и сдвиньте небольшой шпатель под мозг, чтобы сократить черепные нервы и кровеносные сосуды, которые подключены к основанию мозга.

Поместите мозг в чашку Петри холодного HBSS, дополненную антибиотиками, и поместите блюдо под рассекающий микроскоп при низком увеличении. Распоить мозг на спинной поверхности. Удерживая мозг мозжечка, используйте тонкие миппы, чтобы удалить оковы с брюшной стороны мозга и обонятельные луковицы.

Поверните мозг на брюшной аспект и снять остальные околиний. Затем используйте тибры, чтобы удалить мозжечок и использовать изогнутые остроконечные миппы для передачи мозга на кусок фильтровальной бумаги с 11 микрометровой поры на вершине вертолета ткани. Для микродиссекции СВЗ и ГД начните с измельчения мозга на 450 микрометровых корональных секций.

Используйте мокрую ламину, чтобы собрать разделенный мозг в новую чашку Петри, наполненную холодным антибиотиком, дополнил HBSS под рассеченным микроскопом и использовать типсы, чтобы отделить корональные ломтики в передней к задней моде, пока ломтики с боковой желудочков не будут достигнуты. Используйте тонкие щипцы, чтобы сократить тонкий слой тканей, окружающих боковой стенки желудочков, за исключением стриатальной паренхимы и мозоли корпуса и поместите один кончик щипцы непосредственно под корпус мозоли, а другой в ткани непосредственно прилегающих к брюшной области бокового желудочка, чтобы изолировать СВЗ. Вырезать небольшую линию тканей, окружающих боковой желудочек и собирать расчлененные ткани в образец трубки, содержащей дополнительные HBSS раствор.

Когда все ломтики были микродиссектированы с типсами и гиппокампа образование было достигнуто, отказаться от первого ломтика с гиппокампа, в котором ГД по-прежнему неузнаваемым. Чтобы удалить ГД, сначала изолировать гиппокамп от ломтиков и переориентировать микроскоп, чтобы визуализировать границы вокруг ГД. Чтобы собрать ГД, используйте типсы, чтобы сделать разрез между областью ГД и CA1 с последующим вертикальным разрезом между областью ГД и CA3. Затем удалите фимбрию и любые прилегающие ткани и поместите собранную ткань в отдельную трубку антибиотика, дополненного раствором HBSS.

Чтобы разобщить образцы СВЗ и ГД, добавьте трипсин-ЭДТА 0,05% к конечной концентрации 5-10% трипсина-ЭДТА 0,05% в HBSS к каждой трубке в течение примерно 50 минут инкубации при 37 градусах Цельсия. Все использование трипсина или слишком долгое время инкубации может привести к увеличению смертности клеток, негативно влияет на рост клеток. Когда ткань слипается, замените ферментный раствор в течение четырех последовательных моет с одним миллилитром свежей дополненной HBSS за стирку.

После последнего мытья, resuspend переваренных тканей в один миллилитр сыворотки свободной среде дополняется 10 нанограммов на миллилитр эпидермального фактора роста и пять нанограмм на миллилитр основных фибробластов фактор роста на трубку. Затем механически разобщить ткани с нежными трубами семь-десять раз с P1000 пипетки, пока однородный клеточный раствор был получен. Чтобы определить плотность разобщенной клетки DG или SVG, подсчитайте клетки в каждой суспензии на гематоцитометре.

Чтобы расширить клетки в нейросферы, разбавить отдельные популяции клеток в два раза десять до четвертой плотности на миллилитр в сыворотке свободной среде дополняется факторами роста и семян пять миллилитров клеточной подвески в неокрашенных 60 миллиметров диаметром Петри блюда. Затем инкубировать клетки СЗ в течение шести-восьми дней и клетки ГД в течение 10 до 12 дней при 37 градусов по Цельсию для первичного формирования нейросферы. Когда большинство нейросфер имеют диаметр от 150 до 200 микрометров, урожай клеточной суспензии от культур и собирать нейросферы центрифугации.

Повторное поддон нейросферы с помощью мыши химической диссоциации комплект в соответствии с инструкциями производителя, прежде чем собирать клетки с другой центрифугации. Замените супернатант на один миллилитр среды без сыворотки, дополненный факторами роста, и осторожно попытайтесь оценить гранулы примерно в 10 раз. Подсчитайте диссоциированные нейро-клетки, как попродемонстрировано, и отейте клетки в два раза от 10 до четвертой плотности на миллилитр в среде, свободной от сыворотки, дополненной факторами роста в новые 60 миллилитровые чашки Петри.

Затем верните клетку в инкубатор клеточной культуры в течение дополнительных шести-восьми или от 10 до 12 дней по мере необходимости для получения вторичных нейросфер. НЕЙРОсферы SVG и DG, полученные с помощью нейросферного анализа, состоят из недифференцированных sox2 положительных, гнездовых положительных клеток. Примечательно, что полученные SVG нейросферы имеют большие размеры, чем их коллеги из ГД.

Важно отметить, что в условиях дифференциации, SVG и DG полученных нервных стволовых / прародителя клетки мигрируют из нейросфер, образуя псевдомонолайер клеток. В обоих нейрогенных регионах, можно наблюдать наличие Sox2 двойной положительный, nestin двойной положительный, doublecortin двойные отрицательные пары клеток, соответствующие симметричным делений, указывающих на самообувечение. Сотовые пары, в которых одна клетка Sox2 положительная, nestin положительная, и doublecortin отрицательный, а другая клетка Sox2 отрицательный, nestin отрицательный, и doublecortin положительные демонстрации асимметричных деления.

И Sox2 двойной отрицательный, nestin двойной отрицательный, и doublecortin двойные положительные пары клеток, соответствующие симметричным делений, указывающих на дифференциацию. В целом, пропуск изменяет уровень смертности клеток на второй день в пробирке. Нойритогенез можно оценить в нейронах, полученных в результате дифференциации клеток СВГ и ГД нервных стволовых/прагениторов в начале дифференциации.

Как отмечается, длина и последствия невритов увеличивается с дифференциацией. Высокий процент пролиферативных клеток наблюдается в SVG по сравнению с ГД. Хотя процент размножающихся прародителей, которые дифференцируются на зрелые нейроны, аналогичен в обеих нейрогенных нишах. Оба типа клеток также способны дифференцироваться в незрелые нейроны, зрелые нейтроны, клетки-предшественники олигодендроцитов, зрелые олигодендроциты и астроциты.

После получения нейросферы, несколько методов, включая иммуноцитохимию, кальциевую визуализацию, западные помарки и RT-PCR могут быть выполнены для изучения ствола и мультипотенции нервных стволовых / прародителя клеток. Анализ нейросферы может быть применен к генетическим моделям и моделям заболеваний для дальнейшей оценки молекулярных и клеточных процессов, связанных как с распространением, так и с дифференциацией клеток нервного ствола/прародителя.