Параллельный допрос по набору в лигунд-2 для скрининга в Лиганде по шкале GPCR с использованием PRESTO-Tango Assay

Платформа Presto-Tango была разработана для проведения параллельного и одновременного допроса всех неоялотельных GPCRs в геноме человека, в том числе, что сироты цели профиля лиганд-индуцированной бета-арестин 2 вербовки. Платформа Presto-Tango является единственным ресурсом с открытым исходным кодом для профилирования всего генома GPCR в параллельном подходе, используя G белок независимого бета-арестина вербовки анализа. Демонстрация процессора была бы Genevieve Laroche научный сотрудник в моей лаборатории, и Манель Зигаль, кандидат наук в моей лаборатории.

Перед началом процедуры добавьте 20 микролитров по 25 микрограмм на миллилитр поли-L-лизина раствора к каждой колодец соответствующего экспериментального числа из 384 оптических нижних пластин и инкубировать пластины при комнатной температуре от 30 минут до двух часов. В конце инкубации, Флик пластин над раковиной, чтобы удалить избыток поли-L-лизина и добавить 40 микролитров антибиотика антимикотического раствора для каждой хорошо. Затем инкубировать пластины, необходимые для посева клеток при 37 градусах по Цельсию и место остальных пластин на четыре градуса по Цельсию для длительного хранения.

Чтобы посеять клетки HTLA для первичного скрининга, аккуратно промойте слияние 150 миллиметров клеточных культур с 10 миллилитров PBS перед лечением культур с шестью миллилитров 0,05%трипсина ЭДТА на блюдо. Когда клетки отсоединились бассейн ячейки подвески в 50 миллилитров конической трубки, содержащей равный объем DMEM. И собирать клетки путем центрифугации.

Повторно приостановить гранулы в 2,2 раза 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации DMEM и Флик пластин над раковиной, чтобы удалить антимикотический раствор антибиотика. Нажмите пластины, чтобы высохнуть и семян 45 микролитров клеток в каждой хорошо. Затем поместите пластины на 37 градусов по Цельсию и 45%углекислого газа в одночасье.

Для подготовки 384 хорошо ДНК источник пластины для трансфекции распространять 50 нанограмм на миллилитр каждой плазминной бесплатной ДНК кодирования GPRC Танго построить интерес в 0,1X Tris-EDTA за колодец в каждом хорошо пластины 96. Используйте многоканарновую пипетку, чтобы вручную передать 10 микролитров раствора ДНК из каждой скважины из 96 скважин в отдельные скважины одной из 384 хорошо исходных пластин ДНК в четырехместном для каждого состояния, как показано на примере. Затем перенесите 40 микролитров раствора хлорида молярного кальция 0.313 в каждую колодец ДНК-источника пластины и аккуратно смешайте содержимое каждой хорошо.

Добавьте 50 микролитров 2x буфера HEPES к каждому колодец из 384 хорошо пластины источника ДНК с нежным смешивания. После одной минуты передачи 10 микролитров смеси трансфекции ДНК из 384 хорошо ДНК источник пластины в каждый колодец семян клеток HTLA и инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток на ночь. На следующий день декант transfected клеточной среды и медленно добавить 40 микролитров голодающих средних к каждому хорошо заботиться, чтобы не прикасаться к клеткам напрямую.

Затем добавьте 20 микролитров буфера транспортного средства для чередующихся рядов без соединения в 20 микролитров соединения интереса в три раза концентрации в чередующиеся ряды, прежде чем вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Через 16-24 часа после стимуляции декант transfected клеточной среды и добавить 20 микролитров свежеприготовленного реагента свечения к каждой хорошо в течение пяти до 20 минут инкубации при комнатной температуре защищены от света. Затем прочитайте пластины на счетчике люминесценции микро-пластины со временем интеграции одной секунды на колодец.

Для вторичного скрининга, субкультуры HTLA клетки в 100 миллиметровых блюд в пять раз от 10 до шести клеток общей плотности клеток в 11 миллиметров полной среды на блюдо в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, смешанные 10 микрограммов GPCR бесплатно ДНК с 500 микролитров Tris-EDTA раствор хлорида кальция с вихрем следуют добавление 500 микролитров буфера HEPES. После энергичной тряски, инкубировать раствор в течение одной минуты при комнатной температуре и сразу же добавить один миллилитр раствора падение мудрым на клетки.

Аккуратно рок равномерно распределить осадок и место пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день проверьте эффективность трансфекции под флуоресцентным изображением клеток. Сделки, более 50% покрытия являются идеальными.

Аккуратно промойте трансфицированные клетки раствором стихов, прежде чем отсоединить клетки тремя миллилитров 0,05%трипсина EDTA. Соберите разобщенные клетки путем центрифугации и повторно приостанавливайте гранулы в четыре раза от 10 до пятых клеток на миллилитр голодающей средней концентрации. Затем семя 45 микролитров клеток в каждом колодец поли-L-лизин закодированы 384 хорошо пластины и поместить пластину в инкубатор культуры клеток, по крайней мере четыре часа.

Для подготовки половины журнала доза кривой ответ пластины добавить 270 микролитров HBSS дополнен HEPES и антибиотик антимикотических для всех, кроме последнего ряда 96 пластины скважины и добавить 30 микролитров каждого высокого и низкого лекарственного раствора в колодцы строки H.Transfer раствор из каждой скважины строки H в соответствующий колодец строки G с смешиванием и продолжать последовательно разбавлять соединения препарата до последнего ряда пластины пластины достигнут. Используя схему в качестве эталона, смешайте 20 микролитров разбавления низкой колонны из рядов A через G пластины 96 скважин и 20 микролитров высоких разбавлений колонны до скважин B через H 96 скважинной пластины к ранее сидящей пластине 384 скважины. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение как минимум 16 часов.

От 16 до 24 часов после стимуляции декант transfected клеточной среды и добавить 20 микролитров свечения реагента к каждому хорошо в течение пяти до 20 минут инкубации перед чтением пластин на микро пластины люминесценции счетчик с интеграцией времени одной секунды на колодец. В этом репрезентативном эксперименте, из 168 GPCRs, которые были допрошены в первичном скрининге, только рецептор допамина D3 и opsin 5 были претендентами в качестве потенциальных активных целей. Допамин рецептор D3 производится значительное изменение лог2 раза 4,7 в то время как opsin 5 производится несколько ниже ответ 2,39.

Для сравнения, рецептор допамина D2, положительный контроль для первичного экрана производится log2 раз изменение 4,58. Эти кривые реакции от вторичного скрининга показали, что экстракт гранул хроматина производят аналогичные окна сигнала в половине максимальных эффективных значений концентрации к хинпиролу, подтверждая его действительность как активный удар по рецептору допамина D3. Плоская доза кривой похож на отрицательный контроль был произведен для opsin 5 Однако исключая этот рецептор в качестве возможной мишени для экстракта гранул хроматина. Presto-Tango требует особого ухода, как изменчивость в распределении клеток, эффективность трансфекции и серийные разбавления наркотиков может привести к усугубленной ошибке, которая может повлиять на точность данных.

Ортогональные методы, такие как радиолиганда связывания подходов, биолюминесценции резонансной передачи энергии и циклических AMP кальция и интернализации функциональных анализов могут быть использованы для дальнейшего подтверждения и характеристики взаимодействия рецепторов лиганда.