Проверенная lc-MS/MS Panel для количественной оценки 11 лекарствоустойчивых противотуберкулезных препаратов в малых образцах волос

Приверженность пациентов является очень сложной задачей, и метаболизм наркотиков может варьироваться от человека к человеку, поэтому объективное измерение уровня наркотиков может оказаться важным в предотвращении появления резистентности во время лечения туберкулеза. Если бы соблюдение можно было более точно и легко количественно оценить, то медицинские работники могли бы разработать план лечения, который ограничил бы развитие лекарственной устойчивости. Мы разработали первую многопрофильную панель масс-спектрометрии для нескольких препаратов против туберкулеза в небольших образцах волос в одном анализе.

Наша мультимедикаментозная панель требует только одного образца на два миллиграмма на пациента и не использует ни твердого этапа экстракции, ни фильтрации, чтобы предотвратить потерю объема образца. Объективные показатели воздействия наркотиков, измеренные на ранних стадиях курса лечения, потенциально могут предупредить врачей о проблемах с отдельными препаратами в схеме лечения. Образцы волос должны быть распылены в день анализа для точного измерения уровня концентрации препарата.

Для получения образцов волос, после получения письменного информированного согласия, получить материалы готовы в том числе тонкая этикетка, два участника этикетки, ножницы, развернул кусок алюминиевой фольги, спиртовой салфетки и полиэтиленовый пакет. Протрите лезвия ножницами чистой с спиртовой салфеткой. Перейти к задней части головы и поднять верхнюю часть волос с помощью зажима для волос при желании.

Соберите 30 прядей волос с задней части головы и изолировать эту миху рукой. Возьмите ножницы вниз к коже головы и вырезать эту волосы. Аккуратно поместите эту волосы на алюминиевую фольгу.

Положите тонкую этикетку на дистальный конец волосы thatch, лентой его надежно алюминиевой фольги. Дистальный конец является стороной дальше от кожи головы. Сложите над куском алюминиевой фольги на верхней части волосы thatch и положить участника этикетку на верхней части алюминиевой фольги.

Поместите сложенный над куском алюминиевой фольги в полиэтиленовый пакет и положить другой участник этикетки на верхней части полиэтиленового пакета. Для извлечения препарата из образцов волос, весят два миллиграмма каждого образца волос в индивидуально помечены бисером трубки и два миллиграмма чистого образца волос в каждом из 16 дополнительных шариковых трубок. После взвешивания поместите все шариковые трубки в гомогенизатор бисерной мельницы и гомогенизируйте образцы со скоростью 6,95 метра в секунду в течение двух 30-секундных циклов с 15-секундным периодом отдыха между каждым циклом.

После второй гомогенизации добавьте 500 микролитров соответствующей внутренней стандартной смеси к каждому образцу и добавьте 500 микролитров метанола в матричную пустую трубку. Спайк калибровки кривой трубки с соответствующим объемом эталонной стандартной смеси в соответствии с таблицей и место все трубы в 37 градусов водяной бане с нежной тряски в течение двух часов. В конце инкубации перенесите супернатант из каждой шариковой трубки в новые маркированные микроцентрифуговые трубки и добавьте 500 микролитров метанола в бисерные трубки.

Вихрь бисерных трубок и передачи метанола мыть соответствующие микроцентрифуг трубки. Центрифуга образцов и тщательно перенести supernatants в новые трубки, не нарушая волос гранулы. Выпарить жидкость в трубках до сухости при 32 градусах по Цельсию и восстановить образцы с 200 микролитров жидкой хроматографии высокого давления класса воды с 1% кремовой кислоты.

После вихря перенесите образцы жидкости в янтарные флаконы с 250 микролитровыми вставками. Для жидкой хроматографии тандем масс-спектрометрии, сначала установите от двух до 100 миллиметров колонки с размером частиц 2,5 микрометра и 100 ангстрем пор размер с полярной endcapped etherlinked фенол бусы полностью сделаны из пористого кремнезема в колонке отсека. Подтвердите, что в колонке также установлен рекомендованный производителем охранный картридж.

Копировать и вставлять составную информацию, включенную в переходы метода МЛУ-ТБ LCMS. csv файл в поле в окне масс-спецификации. В электронной таблице создайте пакетную последовательность кривой калибровки, контроля качества, образцов пациентов, кривой калибровки, контроля качества, образцов пациентов, кривой калибровки и контроля качества.

Добавить растворитель пустые инъекции в начале и конце запуска, а также до и после кривой калибровки, контроля качества и образцов пациента. Затем поместите по крайней мере восемь растворителей пустые инъекции в инъекции в кривой калибровки и высокое качество контроля флакона, чтобы уменьшить analyte переноски. Когда пакеты будут завершены, откройте программное обеспечение для количественной оценки.

Прокрутите переходы, чтобы убедиться, что автоматически выбранное время удержания является точным, и убедитесь, что gaussian сглаживание установлено на 1,5. Далее нажмите отображает кривую калибровки и регрессию и установите тип ожидания на один над x. Нажмите OK и проясните кривую калибровки и образцы контроля качества, чтобы гарантировать, что пакет успешно работает.

Для каждого эталонного аналита квантификатора, по крайней мере две трети точек калибровки должны иметь точность в пределах 80-120%Проверить, что значение R отображается выше кривой калибровки больше, чем 0,975. Если все вышеперечисленные условия будут удовлетворены, партия прошла и образцы могут быть количественно. Нажмите Редактировать в панели инструментов и нажмите копировать всю таблицу.

Затем вставьте таблицу в электронную таблицу и используйте среднее значение рассчитанной концентрации двух инъекций выборки для определения зарегистрированной концентрации каждого образца. Здесь показана иллюстрация хроматограммы с подтвержденными уровнями всех протестированных 11 лекарственно-устойчивых противотуберкулезных препаратов. На этих цифрах можно наблюдать извлеченные ионные хроматограммы для одного конкретного препарата в одном из калибровотелей.

Квантификатор и квалификационные переходы используются для качественного подтверждения наличия препарата, поскольку соотношение между площадью квантификатора и областью квалификатора остается постоянным в разных образцах. Внутренний стандарт также контролируется для обеспечения нормализации каждой инъекции образца. В этом анализе была оценена удобная выборка из 15 образцов волос среди общей популяции 96 пациентов, принимающих лекарственно-устойчивые противотуберкулезные препараты в непосредственно наблюдаемых условиях терапии из Западной Капской провинции, южная Африка, для определения репрезентативных уровней лекарственно-устойчивых противотуберкулезных препаратов на самом низком и самом высоком уровнях для каждого анализа.

При отсутствии твердой фазы извлечения или фильтрации шаг, заботиться при передаче супернатанта в испаряющиеся трубки. Все, что передается в трубки может в конечном итоге вводят в колонку. Как ротор шарика хищник может улететь, если не плотно привинчены или заблокированы, не забудьте дважды проверить ротор перед работой.

В отличие от антиретровирусных препаратов в области ВИЧ, связь между фармакокинетикой противотуберкулезных препаратов, соблюдением и клиническими исходами остается в значительной степени неизученной. Мы предположили, что некоторые противотуберкулезные препараты не накапливаются хорошо в волосах. Ориентация на метаболиты этих препаратов может обеспечить лучшее понимание приверженности пациента.