Два различных в режиме реального времени Место Предпочтение Парадигмс использованием оптогенетики в вентральной tegmental области мыши
12 февраля 2020 г.
Здесь мы представляем два простых в последующей пошаговые протоколы для парадигмы предпочтения места с использованием оптогенетики у мышей. Используя эти две различные установки, предпочтения и поведение избегания могут быть надежно оценены в одном аппарате с высокой пространственной и временной избирательностью, и в простой манере.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для оценки полезных или аверсивных свойств генетической стимуляции конкретной области мозга. Техника может ответить быстро, если стимуляция конкретных клеток является полезным или обратным. Мы описываем настройки для стимулирования брюшной тегментальной области, но наши протоколы могут быть легко адаптированы для изменения конкретных параметров с точки зрения различных изучаемых регионов.
Для начала используйте однодохонные микроконтроллеры для управления лазерным источником. Загрузите скрипт на доску микроконтроллера, используя соответствующий кабель подключения к компьютеру. Скрипт включает в себя внешнюю модуляцию, исходя из программного обеспечения отслеживания через коробку TTL, и выход на лазер для управления параметрами стимуляции.
Используйте сетевой кабель для подключения коробки TTL к доске. Убедитесь, что лазер установлен для управления внешней модуляции, и подключить лазер к доске с помощью кабеля FC / PC. Подключите соответствующие булавки к наземным частям доски.
Чтобы подключить лазерный источник к оптическому волокну, сначала подключите лазерный источник к вращающемуся суставу. Подключите шнур патча к вращающейся суставу. Стабилизация вращающегося сустава над аппаратом, но за пределами зоны записи.
Убедитесь, что длина волоконно-оптического шнура патч подходит, чтобы мышь двигаться без трудностей на арене. Для калибровки установки арены используйте линейку для измерения определенной части физического аппарата. В программном обеспечении нарисуйте линию, соответствующую измеренной части.
В соответствии с шкалой рисовать для калибровки вкладки введите уже известное значение. Дизайн арены, рисовать области, где движение мышей будут записаны. Создайте зоны, нарисуйте зоны, которые в конечном итоге будут назначены в качестве лазерных пар, лазерных неоплаченных и нейтральных.
Нажмите кнопку Validate Setup, чтобы проверить настройку, чтобы подтвердить отсутствие противоречивых параметров, например, зон за пределами арены. Убедитесь, что аппаратное управление включено, и установите время эксперимента до 30 минут, чтобы повторить опцию til в настройках справочной коробки. Назначьте отсек в качестве лазерного пара, в котором вход мыши вызовет сигнал TTL через программное обеспечение отслеживания на доску микроконтроллера в настройках состояния.
Чтобы изменить настройку для нейтрального подхода предпочтений отсека, после установки арены и времени, назначьте зоны A и B в качестве лазерной пары, добавив, когда центральная точка находится в любой из зоны А и зоны B для коробки условий, связанных с настройками отсеков A и B. Чтобы настроить настройки обнаружения, используйте манекен, похожий на мышь. Поместите манекен в одном отсеке аппарата и используйте автоматизированную установку с динамическим вычитанием.
Снимите манекен и поместите его в противоположном отсеке. Убедитесь, что манекен полностью обнаружен. Поместите манекен в отсек с лазерной парой.
Чтобы проверить, работает ли стимуляция, начните приобретение с помощью ранее настроенных параметров пробного управления и посмотрите, срабатывает ли стимуляция как следует. Затем поместите манекен в неспареный или нейтральный отсек, и посмотреть, если стимуляция остановлена. Используйте ручку на лазере, чтобы установить мощность лазера до 10 милливатт.
Подключите волоконно-оптический имплантат к волоконно-оптическому шнуру с помощью керамического рукава и поместите мышь в нейтральный отсек трехкомитетного аппарата. Подождите, пока мышь не будет обнаружена программным обеспечением. Удалите вертикальные раздвижные двери, ограничивающие проникновение животного в основные отсеки.
Разрешить животному свободно исследовать без каких-либо нарушений. Весь эксперимент по предпочтению места в реальном времени проводится в течение восьми сеансов. Мышей DAT-Cre, вводимых с помощью вируса AAV channelrhodopsin EYFP в брюшной тегментальной области, были протестированы для целевой дофаминергических нейронов.
Мыши провели в среднем около 70% своего времени в лазерном парном отсеке, в отличие от непарного отсека на 20%и нейтрального отсека на 10%Противоположный поведенческий фенотип наблюдался у мышей Vglut2-Cre, введенных с AAV channelrhodopsin EYFP в брюшной тегментальной области. Мыши избегали отсека в паре со стимуляцией и проводили больше времени в неспаре. Во время условных дней ответов пять и восемь, мыши не показали явного избегания ранее парного отсека.
Чтобы еще больше продемонстрировать плодотворную или аверсивную роль конкретных нейронов, описанный метод можно похвалить другими методами, такими как оперонные парадигмы или фотогенетическая подстимуляция. Обратите внимание при обработке вирусов и при использовании лазерных источников.
Обзор
В данной статье представлены два протокола парадигм предпочтения места с использованием оптогенетики у мышей, что позволяет оценивать поведение предпочтения и избегания с высокой пространственной и временной избирательностью.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческий анализ
- Оптогенетика
Теоретические основы
- Понимание поощрительных и аверсивных свойств стимуляции мозга имеет решающее значение в нейробиологии.
- Оптогенетика позволяет осуществлять точный контроль нейронной активности.
- Парадигмы предпочтения места обычно используются для оценки поведенческих реакций на стимулы.
- Данное исследование сосредоточено на вентральной области покрышки и ее роли в процессах вознаграждения.
Цель исследования
- Разработать протоколы для оценки влияния оптогенетической стимуляции на поведение мышей.
- Оценить, как стимуляция конкретных нейронов влияет на предпочтение и избегание.
- Предоставить гибкую установку, которую можно адаптировать для различных областей мозга.
Используемые методы
- Использование одноплатных микроконтроллеров для управления лазерной стимуляцией.
- Калибровка экспериментальной арены для точного отслеживания перемещений мышей.
- Внедрение TTL-сигналов для синхронизации стимуляции с поведением мышей.
- Оценка поведенческих реакций в течение нескольких сессий с использованием мышей разных генотипов.
Основные результаты
- Мыши DAT-Cre проявили предпочтение отделению, связанному с воздействием лазера, проводя там 70% времени.
- Мыши Vglut2-Cre демонстрировали избегание отделения, связанного с воздействием лазера.
- Поведенческие реакции варьировались в разные дни тестирования.
- Данный метод может быть дополнен другими техниками для дальнейшей валидации.
Выводы
- Данные протоколы представляют собой надежный метод изучения влияния специфической стимуляции нейронов на поведение.
- Результаты указывают на наличие различных поведенческих фенотипов в зависимости от генетического фона.
- Дальнейшие исследования могут расширить эти результаты с использованием дополнительных методологий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Оценка поощрительных или аверсивных свойств стимуляции нейронов имеет решающее значение для валидации мишеней при разработке лекарственных препаратов на основе нейробиологических исследований. Парадигмы предпочтения места в реальном времени позволяют проводить быстрый причинно-следственный анализ конкретных нейронных цепей, что способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез. Данный подход обеспечивает количественные поведенческие показатели, которые служат основой для принятия решений о продолжении или прекращении исследований на ранних этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить причинно-следственную проверку того, вызывает ли стимуляция определенной популяции нейронов фенотипы вознаграждения или отвращения.
- Операционная ценность: обеспечивает количественное считывание поведенческих показателей в режиме реального времени с высоким временным разрешением для проверки гипотез.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, связывая активацию нейронов с измеримыми поведенческими результатами, имеющими значение для нейропсихиатрических показаний.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создается стандартизированный, воспроизводимый поведенческий анализ для скрининга нейромодулирующих мишеней с использованием оптогенетической стимуляции.
- Количественные показатели: Формируются показатели времени пребывания в отсеке, которые служат зависимыми переменными для оценки эффектов стимуляции в зависимости от генотипа или условий.
- Масштабируемость: Протокол может быть адаптирован для различных областей мозга и параметров стимуляции, что позволяет проводить кампании по скринингу нескольких мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Стимуляция вентральной области покрышки моделирует функцию мезолимбического пути, что имеет значение для изучения расстройств системы вознаграждения и разработки терапии зависимостей.
- Трансляционная преемственность: Поведенческий мониторинг в режиме реального времени позволяет связать краткосрочные исследования нейромодуляции с долгосрочной оценкой кондиционированного предпочтения места.
- Снижение механистических рисков: Помогает дифференцировать прямые нейронные эффекты от компенсаторных ответов нейронной сети, что уменьшает неопределенность в определении целевого механизма.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод относится к фазе поисковой биологии, в которой валидация мишеней на уровне цепей предшествует идентификации перспективных соединений и тестированию доклинической эффективности.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез путем определения того, вызывает ли оптогенетическая активация специфических нейронов поведение вознаграждения или отвращения.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ и обеспечить воспроизводимость при оценке нейромодулирующих мишеней в различных генетических или фармакологических условиях.
- Аналитика: предоставляет количественные зависимые переменные (время, проведенное в отсеках, связанных с лазером, не связанных с ним и нейтральных) для статистического сравнения эффектов стимуляции.
- Трансляционные исследования: связывает эффекты острой нейронной стимуляции с поведенческими фенотипами, имеющими значение для доклинических моделей процессов вознаграждения.
- Корпоративное повторное использование: данная методика может быть стандартизирована для использования в разных лабораториях и адаптирована к различным областям мозга, что способствует повторному использованию платформы в нейробиологических исследованиях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов нейронной причинно-следственной связи, что позволяет сократить количество ложноположительных результатов при выборе мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает возможность высокопроизводительной оценки поведения с помощью автоматизированного трекинга и управления стимуляцией в режиме реального времени.
- Стратегическая ценность: повышает уверенность в стратегиях модуляции мишеней, что способствует более эффективному распределению ресурсов на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации мишеней с учетом рисков на основе поведенческой валидации специфических эффектов нейронных цепей.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области оптогенетики, доставки вирусных векторов и стереотаксической хирургии для точного воздействия на нейроны.
- Зависит от интегрированного оборудования, включая микроконтроллеры, лазеры, поворотные соединения, оптоволокно и программное обеспечение для отслеживания поведения.
- Необходима межгрупповая стандартизация между специалистами по нейронаукам, инженерами и группами анализа данных для обеспечения согласованности настройки и калибровки.
- Необходимо учитывать вариабельность экспрессии опсинов, расположения волокна и мощности лазерного излучения у разных субъектов.
- Ограничено изучением острых поведенческих эффектов; не позволяет оценить хроническую адаптацию или компенсаторные механизмы без проведения дополнительных лонгитюдных исследований.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
