Комбинированная инфузия и стимуляция с помощью циклической вольтамперометрии быстрого сканирования (CIS-FSCV) для оценки регуляции рецепторов вентральной тегментальной области фазового дофамина

Этот подход может помочь выяснить роль специфической вентральной тегментальной области, соматодендритных рецепторов и фазового высвобождения дофамина в прилежащем ядре. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что вопросы о контроле функции рецепторов над фазовым высвобождением дофамина могут быть решены в интактном мозге. Оптимизация расположения микроэлектрода из углеродного волокна и биполярного стимулятора может быть сложной задачей, и некоторые советы для начинающих — начать запись в дорсальном стриатуме.

В связи с использованием и манипуляциями с различными типами электродов, включая записывающие, референтные и стимулирующие электроды, будет полезно визуальное руководство о том, когда и где эти электроды имплантируются. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс очистите кожу головы крысы под наркозом с помощью трех последовательных скрабов с йодоповидоном и 70% этанолом. После последнего скраба используйте стерилизованный игольчатый пинцет для носа и хирургические ножницы, чтобы вырезать достаточно ткани кожи головы, чтобы освободить место для имплантированных электродов.

Аккуратно очистите открытую поверхность черепа стерилизованными ватными аппликаторами, прежде чем нанести две-три капли 3%-ной перекиси водорода, чтобы помочь определить лямбду и брегму. Затем используйте сверло диаметром один миллиметр, настроенное примерно на 20 000 оборотов в минуту, чтобы сделать отверстие диаметром 1,5 миллиметра, 2,5 миллиметра спереди и 3,5 миллиметра сбоку от брегмы. Вверните винт диаметром 1,59 миллиметра и длиной 3,2 миллиметра примерно на полпути в отверстие, пока винт не будет твердо установлен на месте.

Затем просверлите отверстие для электрода сравнения диаметром один миллиметр в левой полусфере, на 1,5 миллиметра спереди и на 3,5 миллиметра сбоку от брегмы. Вставьте примерно два миллиметра контрольного провода в отверстие, оборачивая провод вокруг и под головкой имплантированного винта. Затем полностью имплантируйте винт, закрепив электрод сравнения на месте.

В правом полушарии просверлите отверстие диаметром 1,5 миллиметра, 1,2 миллиметра спереди и 1,4 миллиметра сбоку от брегмы, и с помощью пинцета осторожно удалите твердую мозговую оболочку. Для стимулирующего электрода просверлите квадратное отверстие в два миллиметра спереди-сзади и пять миллиметров медиально-латерально с центром на 5,2 миллиметра сзади и на один миллиметр латерально от брегмы. С помощью стереотаксических дуг опустите направляющую канюлю биполярного стимулирующего электрода на пять миллиметров ниже твердой мозговой оболочки.

С помощью стержней стереотаксического рычага опустите микроэлектрод из углеродного волокна на четыре миллиметра ниже твердой мозговой оболочки в самой дорсальной части стриатума и соедините контрольный провод и углеродное волокно с потенциостатом. Затем подайте треугольный сигнал с напряжением от минус 0,4 до 1,4 В, 400 В в секунду в течение 15 минут при частоте 60 Гц, а затем 10-минутный стимул с частотой 10 Гц. Чтобы оптимизировать расположение стимулирующего электрода, настройте стимулятор на создание биполярной электрической волны с частотой 60 Гц, 24 импульсами, током 300 микроампер и длительностью импульса две миллисекунды на фазу.

Осторожно опустите стимулятор с шагом 0,2 миллиметра от 5 до 7,8 миллиметров ниже твердой мозговой оболочки, стимулируя ВТА при каждом приращении. Продолжайте опускать биполярно-стимулирующую направляющую канюлю электродов до тех пор, пока стимуляция не приведет к поэтапному высвобождению дофамина на микроэлектроде из углеродного волокна в дорсальном стриатуме. После того, как будет замечен выброс дофамина, опустите микроэлектрод из углеродного волокна до тех пор, пока он не окажется по крайней мере на шесть миллиметров ниже твердой мозговой оболочки в самую дорсальную часть ядра прилежащего ядра.

Когда электрод находится в нужном положении, стимулируйте VTA и зарегистрируйте пиковую амплитуду пика дофамина, затем опустите или поднимите микроэлектрод из углеродного волокна к участку, который производит наибольшее высвобождение дофамина, убедившись, что пик реакции дофамина представлен в виде четкого пика окисления при 0,6 вольт и пика восстановления при минус 0,2 вольт. После того, как расположение канюли с углеродным волокном и стимулирующим электродом будет оптимизировано, стимулируйте животное каждые три минуты в течение 20-30 минут. После достижения стабильного исходного уровня осторожно опустите внутреннюю канюлю вручную в направляющую канюлю, предварительно установленную в биполярный стимулятор, и получите дополнительные две-три базовые записи, чтобы подтвердить, что введение канюли не вызвало изменения вызванного сигнала.

После того, как исходный ответ будет установлен, используйте шприцевой насос и микрошприц для введения 0,5 микролитра исследуемого лекарственного раствора в ВТА в течение двух минут. После инфузии оставьте внутреннюю канюлю на месте не менее чем за одну минуту до удаления, продолжая записывать реакцию каждые три минуты для измерения эффектов после инфузии. Как показано на этих репрезентативных цветовых графиках, инфузия физиологического раствора не изменяет стимулированное фазовое высвобождение дофамина.

Инфузия NMDA приводит к значительному увеличению стимулированного фазового высвобождения дофамина, в то время как конкурентный антагонист NMDA-рецепторов, AP5, вызывает устойчивое снижение. Как неконкурентный антагонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов мекамиламин, так и неселективный конкурентный антагонист мускариновых ацетилхолиновых рецепторов скополамин вызывают устойчивое снижение стимулированного фазового высвобождения дофамина. На этом графике можно наблюдать краткую информацию о влиянии тестируемых препаратов с течением времени.

Канюлю для инфузии необходимо аккуратно ввести в биполярный стимулирующий электрод. В противном случае может произойти чрезмерное повреждение, приводящее к искусственным изменениям фазового высвобождения дофамина. Этот подход позволил исследователям более точно рассмотреть специфические рецепторные механизмы, с помощью которых фазовое высвобождение дофамина регулируется in vivo.