Простой литографии-бесплатно одноклеточных микропаттернинга с помощью лазерной-Cut stencils
3 апреля 2020 г.
Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.
Мы опишем метод литографии на основе трафаретной литографии, свободный от одноклеточных микропаттернов, который преодолевает множество препятствий, связанных с фотолитографией и мягкой литографией. Трафареты многоразовые и процесс недорогой и настраиваемый. Этот метод открыл новый путь для неинженерных исследователей для изучения формы клеток и области индуцированной механотрансдукции в различных физиологических и патологических контекстах.
Кроме того, этот протокол позволяет для микропаттернирования тысяч клеток, которые могут быть использованы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков и моделирования заболеваний в блюде. Визуальная демонстрация облегчит имплантацию двух важнейших шагов: отсоединения крышки от гидрогеля, достаточной сушки гидрогеля перед размещением трафарета. Приготовьте раствор гидрогеля полиакриламина в новой 50-миллилитровой пропиленой центрифуге, как описано в рукописи.
Далее, чтобы подготовить 5%фотоинициатор раствор, растворить ингредиенты в 700 микролитров 100% этанола. Ингредиенты не растворимы в воде, поэтому не забудьте полностью раствориться вихрем. Добавьте 300 микролитров PBS для конечного объема одного миллилитра.
Работая на льду, разбавляют подвальные мембраны матричным белковым раствором с ледяным холодным DMEM F12 media или 1X PBS к оптимизированному соотношению разбавления. Держите на льду для более длительного использования. При работе с мембранной матрицей подвала, убедитесь, что всегда работать на льду и использовать ледяные растворы в охлажденных пипеток советы и трубки.
Поместите УФ-скамейке лампы в биологической безопасности капот. Далее поместите стерилизованные парафиновые пленки, подготовленные ранее. Если парафиновые пленки не полностью сухие, используйте вакуумную систему аспирации для удаления любой остаточной жидкости.
Используя автоматические типсы, поместите шесть автоматических крышки на парафиновую пленку по шесть в каждой чашке Петри. Для подготовки УФ-перекрестного связуемого полиакриламинида окончательное решение, разбавить раствор фотоинициатора с раствором гидрогеля полиакриламинида. Стерилизовать раствор с помощью 50-миллилитрового фильтра с размером поры 0,22 микрометра.
Затем выпейте 200 микролитров УФ-перекрестного полиакриламинида окончательного раствора на каждый из шести стеклянных крышки в чашках Петри. Используя автоматические типсы, тщательно накройте каждую крышку вторым крышкой, улавлив слой раствора между двумя крышками. Поместите чашки Петри, содержащие крышки, под лампу УФ-скамейки с незамечтой крышкой.
Покрытие белой бумаги на небелой поверхности важно, чтобы свести к минимуму потерю УФ-интенсивности. Для защиты от УФ-излучения накройте лампу алюминиевой фольгой. Фотополимеризировать полиакриламид гидрогели в течение пяти минут.
Используйте лезвие бритвы, чтобы тщательно отделить каждую пару coverslips. Заполните резервуар, содержащий шесть гидрогелевых композитов с помощью PBS. После полоскания в течение пяти минут, вернуть гидрогель coverslip композитов парафина пленки в чашке Петри.
Получить трубку Сульфо-САНПА от хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 1 200 микролитров предварительно охлажденного PBS в трубку и перемешайте с помощью трубчатых вверх и вниз. Выдавайте 200 микролитров разбавленного Сульфо-САНПА На парафиновую пленку в чашке Петри.
Поместите гидрогель охватывает композит над Сульфо-САНПАХ с гидрогелем, контактным с Сульфо-САНПА. Далее поместите гидрогель coverslip композитов под УЛЬТРА лампы и подвергать их в течение пяти минут, чтобы активировать Сульфо-SANPAH. Если Sulfo-SANPAH превращается из оранжевого в коричневый, указывающий на успешную активацию и включение, переходите к следующим шагам в течение 10 минут.
Пополнить одноразовый полипропиленовый резервуар свежим PBS. Перенесите активированные гидрогелевые композиты в резервуар и прополощите их на короткое время, чтобы удалить несвехую Сульфо-САНПАХ. Поместите гидрогель coverslip композитов на парафиновой пленки в чашках Петри и тщательно мазок их стерильной ворсинки без салфеток.
Поместите трафарет поверх каждого гидрогеля coverslip композитных. Для обеспечения плотного уплотнения между трафаретом и композитом, удалить избыток влаги путем dabbing с автоклавом ворса без салфеток. Тщательно обойтись разбавленной мембраны мембраны белковый раствор размещения 200 микролитров на вершине каждого гидрогеля coverslip композитных.
Инкубировать конструкции на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день перенесите композиты на тарелку из шести колодец. Плотное уплотнение между гидрогелем и трафаретом может быть легко проверено, наблюдая, сохранился ли раствор матричного белка поверх трафарета.
Неспособность сформировать плотный уплотнитель приводит к быстрой утечке белкового раствора через отверстия. Полностью погрузите композиты в PBS. Используя автоклавный пинцет, тщательно отделяйте трафареты от гидрогелей, не разрывая гидрогели.
Удалите PBS из скважин и пополнить скважины с DMEM. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. После удаления пластины из инкубатора, изучить DMEM.
Если DMEM не облачно, гидрогель coverslip композиты готовы к использованию для покрытия клеток. Стенсилы были изготовлены, содержащий массивы квадратов и прямоугольников. Из трафаретов были получены микропаттерновые гидрогелевые субстраты и острова матричного белка.
Были также получены сотовые острова. Например, острова выведенных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами. Концентрация белка матрицы сыграла важную роль в создании надлежащих моделей.
Оптимальная концентрация привела к однородному распределению белков. Концентрации субоптимального матричного белкового раствора привели к неоптимальной картине. Очень важно использовать переднюю сторону трафарета.
При использовании задней стороны трафарета размер матричных белковых островов увеличивается за счет направления лазерной резки. При использовании задней стороны трафарета существенно не влияет на ширину прямоугольных узоров, высота значительно увеличилась, что привело к снижению предполагаемого соотношения сторон. Узор на основе стенцилей применялся к подстратам кремниевых еластомера.
Узорчатые кардиомиоциты на подложке кремния были визуализированы иммуноцитохимией сердечного тропонина Т при низком увеличении и саркомерным белком альфа-актинин при высоком увеличении. Трафарет на основе шаблона был также применен к шаблону два кардиомиоцитов бок о бок на гидрогели с различными жесткости. Открытие плюрипотентных стволовых клеток и соответствующих протоколов дифференциации человека сделало эту модель человека в пробирке идеальной для изучения онкогенеза и патогенеза.
Однако основным ограничением использования системы IPS является отсутствие структуры микроокнироники, которая имеет особый биохимический состав и жесткость взаимодействия с клетками. Узор можно комбинировать с микроскопией силы тяги и анализами иммуноцитохимии для характеристики структуры и функции кардиомиоцитов. Анализ типов клеток, полученных IPS, в нашем случае кардиомиоцитов, в более физиологической морфологии открывает возможности для изучения сложных кардиомиоцитов в культуре блюдо.
Этот метод также может быть применен ко многим другим системам, таким как и высокое содержание скрининговых пластин. Форма и субстрат могут быть легко приспособлены к приложению.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод микропаттернинга на основе трафаретов без использования литографии, который доступен исследователям с ограниченным опытом в области биоинженерии. Метод предполагает использование многоразовых трафаретов, вырезанных лазером, для создания микропаттернов из белков внеклеточного матрикса, что позволяет модулировать морфологию клеток, в частности, кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Биоинженерия
- Исследования стволовых клеток
Теоретическая справка
- Традиционные методы фотолитографии и мягкой литографии могут быть сложными и дорогостоящими.
- Этот новый метод разработан таким образом, чтобы быть недорогим и настраиваемым.
- Он позволяет исследователям, не являющимся инженерами, изучать форму клеток и механотрансдукцию.
- Микропаттернирование может быть применено к тысячам клеток для высокопроизводительного анализа.
Цель исследования
- Предоставить простой метод микропаттернирования, доступный широкому кругу исследователей.
- Способствовать изучению морфологии клеток и механотрансдукции в различных контекстах.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и моделирования заболеваний.
Используемые методы
- Приготовление раствора полиакриламидного гидрогеля.
- Использование лазерных трафаретов для микропаттернинга.
- Отсоединение покровного стекла от гидрогеля.
- Сушка гидрогеля перед наложением трафарета.
Основные результаты
- Метод позволяет успешно формировать паттерны белков внеклеточного матрикса.
- Он демонстрирует возможность эффективно модулировать морфологию клеток.
- Данный подход пригоден для высокопроизводительного применения.
- Визуальные демонстрации способствуют лучшему пониманию протокола.
Выводы
- Этот метод, не требующий литографии, упрощает процесс микропаттернирования.
- Он открывает новые возможности для исследований в области клеточной биологии и механотрансдукции.
- Данный протокол подходит для широкого спектра применений в биомедицинских исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Этот метод микропаттернинга на основе трафарета, не требующий литографии, устраняет барьеры доступности в анализе единичных клеток, позволяя более широкому кругу групп исследователей и разработчиков изучать механотрансдукцию и определение судьбы клеток без специальных знаний в области микрофабрикации. Поддерживая высокопроизводительное формирование паттернов из тысяч клеток, данный подход повышает прогностическую достоверность в процессах валидации мишеней и фенотипического скрининга. Этот метод снижает техническую сложность и стоимость, способствуя масштабируемому внедрению на этапах раннего поиска и разработки доклинических моделей.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем модуляции формы и размера клеток для изучения путей механотрансдукции в системах, имеющих значение для патологий.
- Практическая ценность: предоставляет надежную и недорогую платформу для функциональной валидации мишеней с использованием кардиомиоцитов, полученных из иПСК, и других типов клеток.
- Прогностическая достоверность: способствует приоритизации портфеля разработок за счет получения количественных морфологических и функциональных показателей, снижающих риски, связанные с механистическими предположениями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей оценки соединений путем создания стандартизированных микропаттернированных подложек с контролируемым представлением внеклеточного матрикса.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования многоразовых трафаретов, вырезанных лазером, и согласованного паттернирования белков на основе гидрогеля.
- Масштабируемость: Поддержка готовности к высокопроизводительному скринингу путем создания массивов паттернов до 2000 клеток на один эксперимент, что облегчает изучение зависимости «доза-эффект» и фенотипическое профилирование.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, соответствующая заболеванию: Применимо к кардиомиоцитам, полученным из иПСК, что позволяет изучать прямоугольную морфологию, характерную для взрослых клеток, которая лучше моделирует физиологическую механотрансдукцию в контексте сердечных заболеваний.
- Трансляционная непрерывность: Связующее звено между фундаментальными исследованиями и доклинической работой, позволяющее оценивать структуру и функцию клеток при различной жесткости субстрата, что способствует согласованию биомаркеров и продвижению исследований с учетом рисков.
- Механистическое снижение рисков: Уменьшает неопределенность в соотношениях «фенотип-генотип» путем изолирования влияния геометрии клеток на сигнальные пути, что повышает прогностическую ценность для трансляции in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс исследований — от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений, обеспечивая стандартизированную подготовку клеток для проведения механистических и фенотипических анализов.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, обеспечивая точный контроль формы и площади клеток для изучения механотрансдукции в моделях на основе иПСК.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и количественные результаты за счет воспроизводимого микропаттернинга тысяч клеток, что позволяет проводить надежный скрининг соединений при моделировании заболеваний.
- Аналитика: Генерирует измеримые показатели, такие как ориентация клеток, формирование белковых островков и морфометрические параметры, которые помогают исследователям сравнивать условия при генетических или фармакологических воздействиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя создавать паттерны на регулируемых субстратах (например, силиконовом эластомере) для оценки ответов, зависящих от жесткости, что актуально для фибротических или ишемических моделей сердца.
- Корпоративное использование: Позиционирует метод с использованием трафарета как многократно используемую технологию для различных проектов, что сокращает избыточность этапов подготовки и способствует внедрению метода в разных исследовательских группах, занимающихся механобиологией и платформами фенотипического скрининга.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности с помощью контролируемого микропаттернинга отдельных клеток.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость благодаря использованию многоразовых трафаретов и паттернинга на основе гидрогелей, совместимого со стандартными рабочими процессами культивирования клеток.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет обеспечения раннего обнаружения фенотипических ответов, зависящих от формы клеток, что снижает биологические риски на поздних стадиях в программах, сосредоточенных на сердечно-сосудистых заболеваниях и механотрансдукции.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем генерации высокосодержательных данных, связанных с морфологией, которые служат основой для выбора мишени и оптимизации соединений-лидеров.
Особенности реализации
- Требуются базовые навыки в области культуры клеток и молекулярной биологии; специализированная подготовка по микрофабрикации не требуется.
- Необходим доступ к источнику УФ-излучения, изготовление трафаретов методом лазерной резки (возможно выполнение на аутсорсе) и стандартные реагенты для гидрогелей (например, акриламид, Sulfo-SANPAH).
- Необходима межкомандная стандартизация ориентации трафарета и приготовления гидрогеля для обеспечения единообразия паттернинга белков и контроля соотношения сторон.
- При адаптации метода следует учитывать совместимость с подложками (например, стеклом, эластомерами) и оптимизацию белков внеклеточного матрикса для конкретных типов клеток.
- Практические ограничения включают необходимость осторожного обращения с трафаретом во избежание разрывов гидрогеля и точного соблюдения времени при активации Sulfo-SANPAH для обеспечения эффективной иммобилизации белков.
