Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности
26 июля 2021 г.
Этот протокол описывает процесс изготовления липидных сетей нанотрубок с использованием скользящей подвижности кинезина в сочетании с гигантскими одноламеллярными липидными везикулами.
Этот протокол позволяет просто генерировать крупномасштабные сети липидных нанотрубок, в которых отдельные нанотрубки демонстрируют поведение разделения фаз, аналогичное поведению родительского пузырька. Ключевым преимуществом этого подхода является то, что мы кооптируем работу, проделанную молекулярными двигателями, для самостоятельной сборки липидных нанотрубок очень параллельным образом и без вмешательства человека. Чтобы настроить анализ скользящей подвижности, сначала прикрепите три комплекта двусторонних ленточных полос на стеклянный слайд на расстоянии пяти миллиметров друг от друга.
Аккуратно прижмите крышку на ленту и добавьте 30 микролитров одномикролярного раствора кинезина в подготовленную проточную ячейку. Через пять минут добавьте в клетку 30 микролитров раствора микротрубочек размером 10 микрограмм/миллилитр, осторожно прижимая лабораторную салфетку к противоположному концу проточного канала, чтобы облегчить обмен раствором. После еще одной пятиминутной инкубации промыть клетку один-три раза 50 микролитрами раствора для подвижности комнатной температуры за одну промывку, прежде чем добавлять 30 микролитров раствора стрептавидина 10 мкг/миллилитр стрептавидина в проточную клетку.
Через 10 минут добавьте 30 микролитров 10-кратного раствора ГУВ для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Затем добавляют два микролитра 100-миллимолярного раствора AMP-PNP и закрывают камеру герметиком. Перенесите проточную камеру в перевернутый микроскоп для визуализации и выберите соответствующий набор фильтров.
Используйте масляный объектив 100X, чтобы сфокусировать сначала поверхность скольжения крышки, прежде чем получить изображение интересующей сети. Затем откройте изображение в ImageJ и щелкните Изображение, Цвет и Композит, чтобы наложить красный и зеленый каналы для создания составного изображения. После получения изображения откройте интересующее изображение и нажмите «Проанализировать и установить масштаб», чтобы откалибровать шкалу для микроскопа.
Введите пикселы в коэффициент пересчета микрометра и нажмите кнопку ОК. Используйте инструмент многоточечной линии для трассировки нанотрубок, начиная с родительского GUV, а также нажмите и удерживайте Control и M для измерения длины. Инструмент обработки изображений будет сохранять каждое новое измерение в окне результатов. Когда все трубки будут измерены, выберите Изображение, Настройка и Пороговое значение и нажмите кнопку Применить, чтобы применить пороговое значение.
Затем нарисуйте прямоугольник известной длины над нужной трубкой. Чтобы измерить интегрированную плотность области, нажмите «Анализировать и измерять» Чтобы определить разделение липидов в узлах жидких нанотрубок, используйте инструмент «Линия», чтобы провести линию над интересующим узлом и измерить интенсивность узла как в зеленом, так и в красном каналах. В этом репрезентативном анализе были изготовлены сети жидких нанотрубок, которые, как было продемонстрировано, генерируют жидкие неупорядоченные и упорядоченные фазы, а также фазовые везикулы.
Например, везикулы, синтезированные с 45% насыщенными липидами и 55% ненасыщенными липидами, приводят к образованию везикул, которые разделяются на сосуществующие жидко-неупорядоченные и твердые фазы. Однако, если включить холестерин, можно наблюдать сосуществование жидкости и жидкости, создавая ГУВ, которые разделяются на сосуществующие жидко-упорядоченные и жидко-неупорядоченные фазы. Кроме того, узлы могут наблюдаться внутри фазоразделенных смесей.
Самое главное, что нужно помнить, это выбрать подходящее время экспозиции и установить фильтр ND, чтобы иметь возможность визуализировать липидные нанотрубки без фотоотбеливания флуорофоров. Адаптация состава фазового поведения липидных нанотрубок позволяет использовать минималистичную модельную систему, чтобы начать изучение биофизики туннельных нанотрубок, соединяющих клетки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол позволяет осуществлять простое создание крупномасштабных сетей липидных нанотрубок с использованием скользящей моторики кинезина. Отдельные нанотрубки демонстрируют поведение фазового разделения, аналогичное поведению родительских везикул.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Липидные нанотрубки имеют важное значение для изучения динамики мембран.
- Моторы кинезина способствуют самосборке липидных структур.
- Фазовое разделение в липидных системах может дать представление о клеточных процессах.
- Данный метод повышает масштабируемость производства нанотрубок.
Цель исследования
- Эффективное создание сетей липидных нанотрубок.
- Использование молекулярных моторов для самосборки без вмешательства человека.
- Изучение фазового поведения липидных нанотрубок.
Используемые методы
- Подготовка анализа скользящей подвижности с использованием кинезина и микротрубочек.
- Использование двустороннего скотча для создания проточной кюветы на предметном стекле.
- Последовательное добавление растворов кинезина и микротрубочек.
- Промывка и добавление стрептавидина для облегчения формирования нанотрубок.
Основные результаты
- Успешное создание сетей липидных нанотрубок.
- Демонстрация поведения фазового разделения в нанотрубках.
- Высокая масштабируемость метода благодаря использованию молекулярных моторов.
- Потенциальные возможности применения в изучении динамики мембран и клеточных процессов.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изготовления липидных нанотрубок.
- Использование кинезиновых моторов обеспечивает эффективную самосборку.
- Этот подход может способствовать развитию исследований в области биологии липидов и динамики мембран.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Быстрое создание многокомпонентных сетей липидных нанотрубок с использованием анализа скольжения кинезина позволяет создавать масштабируемые и воспроизводимые модели in vitro для изучения мембранного транспорта и биофизики липидов. Этот подход способствует исследованиям на ранних стадиях, предоставляя настраиваемые, биологически релевантные системы, имитирующие сложность клеточных липидных трубочек. Данный метод повышает прогностическую достоверность механистических исследований и эффективности отбора кандидатов при поиске терапевтических средств, воздействующих на мембраны.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы мембранного транспорта в контролируемой, настраиваемой системе.
- Обеспечивает функциональную валидацию молекулярных мишеней, участвующих в динамике и транспорте липидов.
- Способствует снижению механистических рисков путем моделирования фазового разделения и поведения распределения липидов.
- Предоставляет платформу для проверки гипотез о взаимодействиях липид-белок, имеющих значение для путей развития заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимое и масштабируемое получение сетей липидных нанотрубок для последующих анализов.
- Позволяет проводить количественное измерение длины и ширины нанотрубок, а также распределения липидов для стандартизации анализа.
- Обеспечивает быстрое создание сложных липидных систем с использованием стандартного лабораторного оборудования.
- Поддерживает скрининг соединений, влияющих на структуру мембран или процессы транспорта.
Трансляционные и доклинические исследования
- Предоставляет релевантную с точки зрения патологии модель для изучения туннельных нанотрубок, участвующих в межклеточной коммуникации.
- Способствует поиску трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность анализа фазового поведения и распределения липидов.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации методов воздействия на мембраны.
- Снижает биологическую неопределенность при выборе доклинической модели для соединений с мембранной активностью.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий: от ранних механистических исследований до разработки доклинических моделей для мембранно-ассоциированных мишеней.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей липид-опосредованного транспорта и сигналинга.
- Скрининг: Позволяет создавать воспроизводимые сети липидных нанотрубок с регулируемыми свойствами, готовые для проведения анализа.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение размеров нанотрубок и распределения липидов для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Позволяет связать полученные in vitro данные о механизмах с мембранными явлениями, имеющими значение при заболеваниях.
- Корпоративное использование: Предлагает стандартизированную масштабируемую платформу, адаптируемую для различных исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях биологии мембран.
- Операционная ценность: оптимизирует процессы изготовления, стандартизации и воспроизводимости сложных липидных систем.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала для портфелей препаратов, нацеленных на мембраны.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию терапевтических кандидатов с мембранной активностью с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются знания в области биофизики липидов и флуоресцентной микроскопии для проведения количественного анализа.
- Необходимо стандартное лабораторное оборудование для сборки проточной кюветы и получения изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и измерений.
- Метод адаптируем к различным липидным составам и модельным системам для удовлетворения разнообразных исследовательских целей.
- Результаты зависят от тщательного контроля параметров визуализации для предотвращения фотообесцвечивания флуорофоров.
