Отбор проб и анализ сигналов запаха животных

Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении с животными. В частности, мы используем твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией для анализа летучих компонентов запахов животных и запаховых меток.

Роль, которую играет запах в общении с животными, в настоящее время недооценивается и поэтому недостаточно изучена. В частности, очень мало известно о химических изменениях, лежащих в основе обонятельных сигналов у животных, включая людей. И это также связано с методологическими проблемами, регистрирующими и количественно оцененными химическими соединениями запахов, используемых животными для общения.

Существует несколько потенциальных проблем при работе с очень сложными химическими смесями, и они также включают в себя отбор проб и анализ образцов запаха. Мы проводим анализ запахов, используемых животными, чтобы понять, как они могут быть использованы ими, когда они общаются друг с другом. Мы объединили цитохимию с биоэкологической эндокринологией и цитологией, чтобы улучшить наше понимание роли запаха в общении с животными.

Для нашей нынешней методологии в Вулверхэмптоне мы приняли технику твердофазной микроструктуры Headspace в сочетании с газовой хроматографической масс-спектрометрией, построенной на и невидимой методологии, используемой в прошлом. Запахи образцов собираются одним из следующих способов. Во-вторых, спонтанно высвобождались запахи образцов от привычных испытуемых.

Например, приматы зоопарка собирают секрет запаха железы запаха путем маркировки запаха на стерильной фильтровальной бумаге или образцах мочи непосредственно во флаконы. Во-вдвоенные после обучения испытуемые с помощью положительного подкрепления собирают выделения запаха, втирая аромат взгляда стерильными ватными тампонами. В-третих, после седации испытуемых собирают секреты запаха путем протирания пахучих желез стерильными ватными тампонами, образцов в стерильные 10-миллилитровые винтовые колпачки, прозрачные стеклянные флаконы и уплотнение с винтовыми крышками, включающими силиконовый сектор P T F E.

Сразу же храните флаконы при минус 20 градусах Цельсия. Обратите внимание, что во время отбора проб очень важно использовать чистые средства индивидуальной защиты, такие как нитриловые перчатки. Сменные перчатки часто избегают прямого контакта кожи с образцами и флаконами.

Предпочтительно использовать совершенно новые флаконы. Однако в случае использования флаконов жизненно важно предварительно очистить флаконы, а затем использовать тот же протокол. Берите экологические заготовки каждый раз, когда собираются ароматические метки.

Сделайте это, подвергнув воздействию неиспользованной фильтровальной бумаги или ватного тампона и флаконов на окружающую среду во время отбора проб. Образцы готовятся в полевых условиях. Для аромата, отмеченного фильтровальной бумагой, вырежьте примерно 10-миллиметровый квадрат из бумаги и поместите в 10-миллилитровый винт с верхом головки флакона.

Для тампона отрежьте головку тампона в самом конце стержня тампона и поместите в головной флакон. После того, как каждый образец был подготовлен, утилизируйте или очистите лезвие, используйте для разрезания среды для отбора проб, с помощью соответствующей антибактериальной салфетки и / или спирта и тщательно высушите. Храните все образцы при минус 20 градусах цельсия.

Обратите внимание, что образцы должны храниться при минус 20 градусах Цельсия, однако в полевых условиях хранить при самой низкой температуре и переносить до минус 20 градусов цельсия при первой же возможности. Перед анализом извлеките образцы из морозильной камеры и дать естественно доходить до комнатной температуры не менее одного часа. Настройте аналитические методы на GCMS следующим образом для условий анализа SPMS, следуйте указаниям производителя по кондиционации волокон SBME перед первым использованием.

Крайне важно, чтобы сборка SBME была правильно установлена в автоматическом пробоотборнике и чтобы она была выровнена с блоком кондиционирования волокна автопробоотборником и входным портом GC. Неправильное выравнивание может привести к повреждению или разрушению волокна Sbme. Убедитесь, что подача газа окуня к блоку кондиционирования волокна включена.

Для улучшения согласованности времени удержания образца аналитическим методом является блокировка времени удержания, добавьте флаконы для образцов в лоток автоматического пробоотборник, поместите пустой флакон с головкой, чтобы действовать как системная заготовка в первом положении лотка автоматического пробоотборник. Поместите заготовку окружающей среды во второе положение, а затем поместите все оставшиеся образцы для анализа в последующие положения лотка автоматического пробоотборники. Создайте аналитическую последовательность для анализа каждого образца в лотке для образцов.

На главном экране массового охотника выберите последовательность в строке меню, а затем загрузите последовательность из раскрывающегося меню. Пустая таблица последовательностей будет отображаться полной таблицей последовательностей для всех пробелов и образцов путем вставки соответствующей информации, сохраненной как заполненная таблица последовательностей. Обратите внимание, что точная информация для таблицы последовательностей будет зависеть от форматирования таблицы лабораториями.

Минимальная информация обычно включает имя образца типа образца, расположение файла и число аналитического метода, а также расположение файла данных и выделение имени файла данных, которое соответствует имени образца в будущем обработке данных. Дополнительные образцы могут быть добавлены к последовательности во время анализа. Запустите последовательность, выбрав последовательность в строке меню, а затем запустите последовательность.

После анализа образцы возвращаются в морозильную камеру в кратчайшие сроки. Обратите внимание, что может быть возможен повторный анализ образцов. Но следует отметить, что некоторые летучие компоненты, возможно, были полностью извлечены во время первоначального анализа, а некоторые соединения, возможно, подверглись термическому и бактериальному разложению при 40 градусах Цельсия.

Таким образом, результат на хроматограмме может быть не полностью репрезентативным для оригинальной ароматовой маркировки. Анализ исходных данных включает интеграцию хроматограмм для получения данных о времени удержания и пиковой площади вместе с предварительной идентификацией пиков с использованием программного обеспечения кулачковой станции и баз данных масс-спектральных баз данных гнезда. Анализ данных может проводиться как вручную, так и полуавтоматическим методом.

Если используется полуавтоматический метод, то иногда полезно провести ряд ручного анализа данных для проверки предварительных идентификаций. Для начала анализа данных откройте файл данных, нажав на соответствующий файл в левой навигационной панели. Общая ионная хроматограмма TIC будет отображаться в верхнем окне экрана анализа данных.

Чтобы интегрировать TIC с помощью интегратора RTE, сначала выберите хроматограмму в строке меню, а затем выберите интегратор из выпадающего меню, откроется всплывающее окно и выберите интегратор RTE. Вернитесь в меню хроматограммы и выберите интегрировать. Чтобы настроить параметры интеграции таким образом, чтобы были интегрированы пиковые или более чем в три раза базовый шум, снова выберите хроматограмму в строке меню, а затем параметры интеграции MS Signal из раскрывающегося меню.

Во всплывающем окне отрегулируйте минимальную пиковую область соответствующим образом 1.0 дает приемлемые результаты в наших примерах. Чтобы определить пиковые пики и создать сводный отчет, выберите экспортировать отчеты в строке меню, а затем отчет о результатах поиска библиотеки в XLS. Обратите внимание, что спектральные библиотеки, которые будут искаться вместе с количеством отображаемых совпадений библиотек, должны быть предварительно установлены в программном обеспечении, прежде чем можно будет выполнить поиск библиотеки.

Полученный отчет электронной таблицы содержит данные интеграции для каждого пика и предварительное сопоставление спектральной библиотеки для назначения идентификатора. Как правило, качество библиотеки или соответствие библиотеки должно быть больше 80, чтобы принять предварительную идентификацию. Сохраните электронную таблицу.

Чтобы определить пик непосредственно из ТИЦ, выберите интересующие пики. Если пик небольшой масштаб, нарисовав поле вокруг пика, удерживая левую кнопку мыши вниз, растяните поле над пиком и отпустите кнопку мыши. Поместите курсор так, чтобы она находились в самой высокой точке пика или сразу после.

Двойной щелчок, правая кнопка мыши и массовый спектр для пика появятся в нижнем окне экрана анализа данных. Для поиска в спектральной библиотеке переместите курсор в любое место в спектральном окне и дважды щелкните правой кнопкой мыши, результаты поиска библиотеки появятся в новом окне. Чтобы сначала удалить фоновый шум из интересующего спектра, дважды щелкните правой кнопкой мыши на рассматриваемом пике, затем щелкните правой кнопкой мыши в области без пиков непосредственно перед пиком интереса, нажмите кнопку вычитания на ленте меню или выберите хроматограмму для строки меню, а затем вычтите спектры из раскрывающегося меню.

Вычитанный спектр будет отображаться в нижнем окне экрана анализа данных и будет отображать тире рядом с данными сканирования в заголовке окна. Следуя этому протоколу, мы предварительно идентифицировали в общей сложности 32 летучих химических соединения из анализа 14 генитальных запаховых меток, спонтанно высвобождаемых на фильтровальной бумаге красными взъерошенными лемурами, и сравнили профили запаха с особенностями сигнальщика, встречающиеся в природе летучие соединения, такие как углеводороды, терпены, спирты Турпина и кетоны, присутствующие в этих профилях, и включают соединения, которые, как было обнаружено ранее, действуют как половые гормоны и сигналы к пригодности. у других видов животных. Соединения, которые были предварительно идентифицированы, перечислены в таблице первой.

Репрезентативные хроматограммы одна из контрольной и одна из ароматических меток Лимы показаны на рисунке один. Количество и относительное изобилие компонентов варьировалось от образца к образцу у разных субъектов исследования. Однако шесть соединений, помеченных от A до F на хроматограмме, присутствовали во всех образцах.

Эти соединения представляли соответственно изгибы на высоту до острова Е один гексанальный паракристалл шесть парамента два восьми красителя один два пинена четыре и пентодекан. Результаты этого исследования показали, что красные взъероженные лемуры используют отправленную маркировку для передачи информации о поле и женском возрасте без генитальной маркировки, играющей роль в социально-сексуальном общении. Другим репрезентативным результатом после использования этого протокола было наше исследование рекламы фертильности самками оливковых бабуинов.

Мы идентифицировали в общей сложности 74 летучих соединения из анализа 395 образцов вагинального запаха женского бабуина. К ним относится ряд встречающихся в природе пахучих летучих соединений, таких как кетоны, спирты, альдегиды, терпены, летучие жирные кислоты и углеводороды. Типичные хроматограммы, используемые для сравнения образцов вагинального запаха тролля и самки бабуина из фертильного и неплодильного периодов, показаны на рисунке два.

Мы исследуем взаимосвязь между профилями вагинального запаха и сексуальной восприимчивостью самок бабуинов. Наши результаты показали, что общее количество вагинального запаха отличается в зависимости от фертильности, предполагая, что запах может играть роль в сигнализации плодовитости самок бабуинов. Мы также обнаружили различия во вагинальном запахе между типами групп, но мы не могли различить эффекты состава группы, женской возрастной нечистоты.

Это совокупные преимущества отбора проб и использования GCMS. Таким образом, использование твердофазной микроэкстракции в головном пространстве позволяет анализировать широкий спектр различных образцов с использованием GCMS. Мы можем отделить компоненты этих сложных меток, а затем идентифицировать каждый из этих отдельных компонентов с помощью масс-спектрометра.

И потом, таким образом, вся комбинированная техника очень мощная и дает нам много информации об этих запаховых маркировках, которые в прошлом были бы большим количеством извлечения пробоподготовки, необходимой для получения результатов.