Метод скрининга для выявления гетерохроматина-пропагандирующих наркотиков с использованием дрозофилы
12 марта 2020 г.
Дрозофила является широко используемой экспериментальной моделью, подходящей для скрининга препаратов с потенциальными приложениями для терапии рака. Здесь мы описываем использование drosophila пестрые фенотипы цвета глаз в качестве метода для скрининга малых молекул соединений, которые способствуют образованию гетерохроматина.
В настоящее время нет препаратов, которые хорошо зарекомендовали себя в содействии формированию гетерохроматина. Здесь мы представляем простой и эффективный метод выявления небольших молекул соединений, которые способствуют этому процессу. Наш протокол скрининга обеспечивает простую, недорогую, простую в использовании систему in vivo для идентификации наркотиков, пропагандирующих гетерохроматин.
Выявление соединений, которые способствуют формированию гетерохроматина может привести к открытию механизмов рака, что починка и терапии рака. Эта экономически эффективная была измерена для выявления гетерохроматина поощрения соединений в Drosophila также может быть использован для подсчета формы хитов, как это превентивная мера для самого высокого клеточного пула клеточного скрининга. Наш протокол скрининга также может быть полезен для быстрых пилотных экранов, так как эта система Drosophila TranSheet производит пестрый фенотип цвета глаз, который обратно коррелирует с количеством гетерохроматина, присутствуют на лету.
Помочь продемонстрировать процедуру будет Кенни Дао, студент-студент из нашей лаборатории. После выявления и подготовки библиотеки наркотиков для скрининга с использованием соответствующего растворителя, и желаемой концентрации, крест трех самцов мух с тремя или более девственными самками мух в 25 на 95 миллиметров пищевой флакон. С девятью миллиметрами стандартной дрозофилы пищевой среды.
Настройка трех реплик флаконов для каждого препарата. Добавьте один контрольный флакон для экрана. И позволить мухам откладывать яйца в течение двух дней при комнатной температуре.
На второй день креста, анестезировать мух с коротким взрывом углекислого газа. И отбросить родителей летит в бутылке, содержащей 70% этанола. Далее разбавляют каждое лекарственное соединение из первоначального запаса для участия в микро-молярной конечной концентрации в 33%DMSO в воде.
И добавить 60 микролитров препарата, или контроль 33%DMSO только, на вершине мухи пищи. Затем подтвердите, что в флаконах нет родительских мух. И добавьте раствор препарата в соответствующие флаконы.
Через два дня после появления мух F1, передача анестезированных мух из одного флакона в то время, на пористой вскрытой площадке с углекислым газом фильтрации через из-под фильтровальной бумаги. Под рассечением микроскопа, изучить каждую всю муху, выявление всех гетерозиготных самцов по их отсутствию кудрявый о-доминирующей фигурные фенотип крыла. Оценка цвета глаз каждого гетерозиготного самца по шкале от одного до пяти.
С одной оценкой присваивается менее 5%красный рассеянный глаз общей площади поверхности. Добавить два балла мух с 6 до 25%красное пятно глаз общей площади поверхности. Три мухи с 26 до 50%красное пятно глаз общей площади поверхности.
Четыре мухи с 51 до 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. И пять мух с более чем 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. Затем вычислите средний цветовой индекс всех самцов с каждого флакона, забитого в трипликате.
Чтобы подтвердить, что соединения действительно способствуют формированию хетерохроматина, можно выдать другой метод проверки, такой как западный blotting. В этом репрезентативном эксперименте, небольшая библиотека молекулы наркотиков, онкология набор 3, который состоит из 97 FDA уполномоченных онкологических препаратов, был проверен с помощью штамма DX1 Drosophila Меланогастер. Согласно скрининговому анализу, метотрексат, закодированный как E7 в библиотеке, вызвал наибольшее изменение штамма Dx1.
Предполагая, что метотрексат может быть наиболее перспективным гетерохроматин содействия препарат для будущей терапии рака целевых. Для дальнейшего подтверждения того, что это соединение способствует трансформации гетерохроматина, западные данные пятно было выполнено. Демонстрация регуляции гетерохроматина форматина связанного белка, триметилирования H3K9 и проверки результатов скрининга.
Критическим шагом является оценка цвета глаз каждого из белых 11-18 DX1 гетерозиготных самцов мух по шкале от одного до пяти в соответствии с предопределенным маршрутом исследования. Мы можем использовать западные помарки или иммуностимуляторы для подтверждения попаданий. Открытие соединений, которые, как предполагается, способствуют формированию гетерохроматина, также может привести к открытию IV генетического механизма развития рака и клинических испытаний у пациентов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен метод скрининга низкомолекулярных соединений, способствующих формированию гетерохроматина, с использованием Drosophila. В этом подходе в качестве индикатора уровня гетерохроматина используются фенотипы мозаичного окраса глаз, что обеспечивает создание простой и эффективной системы in vivo для идентификации лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Скрининг лекарственных препаратов
- Генетика
Теоретические основы
- Гетерохроматин играет важную роль в регуляции генов и функционировании клеток.
- Современные методы стимуляции формирования гетерохроматина ограничены.
- Drosophila служит эффективным модельным организмом для генетических исследований.
- Фенотипы с пестрым цветом глаз могут указывать на уровни гетерохроматина in vivo.
Цель исследования
- Разработать экономически эффективный метод идентификации соединений, способствующих формированию гетерохроматина.
- Использовать Drosophila в качестве модели для скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов.
- Разработать простой в исполнении и недорогой протокол.
Используемые методы
- Скрининг низкомолекулярных соединений на Drosophila.
- Оценка фенотипа цвета глаз как показателя наличия гетерохроматина.
- Реализация простого протокола скрининга in vivo.
- Оценка корреляции между цветом глаз и уровнем гетерохроматина.
Основные результаты
- Протокол скрининга успешно выявил соединения, способствующие формированию гетерохроматина.
- Фенотипы пестрого окраса глаз коррелировали с количеством гетерохроматина.
- Метод оказался эффективным и экономически выгодным для идентификации лекарственных препаратов.
- Обсуждались потенциальные возможности применения в терапии рака.
Выводы
- Данное исследование предлагает новый подход к скринингу лекарственных препаратов в онкологических исследованиях.
- Drosophila могут эффективно использоваться для идентификации соединений, способствующих формированию гетерохроматина.
- Полученные результаты могут способствовать пониманию механизмов развития рака и методов его терапии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод представляет собой экономически эффективную систему in vivo для идентификации соединений, стимулирующих образование гетерохроматина, что восполняет пробел в поиске эпигенетических препаратов для терапии рака. Использование вариегации глаз Drosophila в качестве количественного показателя позволяет проводить валидацию мишеней на ранних стадиях и снижать риски, связанные с механизмами эпигенетики. Данный подход обеспечивает прогностическую уверенность при идентификации ведущих соединений и сортировке портфеля в программах по поиску препаратов для онкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с формированием гетерохроматина и эпигенетической регуляцией при раке.
- Практическая ценность: предоставляет простую и недорогую систему in vivo для функциональной валидации эпигенетических модификаторов как мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем установления связи между действием соединений и изменениями белков, ассоциированных с гетерохроматином, таких как триметилирование H3K9.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные оценки цвета глаз (1–5), которые коррелируют с уровнями гетерохроматина, для приоритизации соединений.
- Практическая ценность: предлагает стандартизированный, воспроизводимый протокол с использованием оценки трех повторностей в пробирках и расчета среднего индекса цвета.
- Готовность анализа: обеспечивает надежную оценку соединений в системе, релевантной заболеванию, при минимальной инфраструктуре.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: связывает результаты исследований на Drosophila с механизмами развития рака у человека посредством консервативных эпигенетических путей.
- Доклиническая преемственность: обосновывает решения по продвижению кандидатов с учетом рисков путем валидации хитов с помощью ортогональных методов, таких как вестерн-блоттинг.
- Механистическое снижение рисков: способствует выяснению эпигенетических механизмов развития рака с помощью идентифицированных соединений, способствующих формированию гетерохроматина.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применим на этапах от первичного поиска до идентификации ведущих соединений, предоставляя данные эпигенетического скрининга, которые используются для оптимизации хитов в ведущие соединения в рамках онкологических программ.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез об эпигенетических мишенях и уточнение путей передачи сигнала с помощью показателей формирования гетерохроматина.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу биологические системы с количественными, масштабируемыми результатами для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить сравнения на основе данных с помощью среднего цветового индекса и статистического анализа результатов в трех повторностях.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклинической валидацией путем подтверждения хитов с помощью биомаркеров белков гетерохроматина.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для эпигенетического скрининга различных классов онкологических мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности в эпигенетической регуляции.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость за счет простого скоринга in vivo и тестирования повторностей.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышает эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних стадиях разработки эпигенетических препаратов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение соединений с учетом рисков на основе их активности по стимулированию формирования гетерохроматина.
Особенности реализации
- Требуется опыт в генетике Drosophila и работе с соединениями для подготовки библиотек.
- Необходимы стандартный диссекционный микроскоп и инструменты для оценки фенотипа цвета глаз.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия при подготовке пробирок, оценке и интерпретации данных.
- При распространении метода на другие модельные системы или классы соединений необходимо учитывать особенности адаптации.
- Существуют практические ограничения, такие как субъективность оценки и необходимость ортогональной валидации выявленных хитов.
