Анализ врожденных пороков сердца в эмбрионах маусов с использованием квалификационных и количественных гистологических методов

Этот протокол стандартизирует новые методы анализа тканей, чтобы они могли быть более широко использованы другими группами, которые также изучают врожденные пороки сердца. Поскольку как качественные, так и количественные методы анализа имеют свои плюсы и минусы, эта методология использует как для решения широкого круга экспериментальных вопросов. Эти методы могут оказать положительное влияние на методы кардиологической диагностики.

Например, патологоанатомы могли бы применить наши микроскопические методы анализа сердечной ткани для диагностики заболеваний сердца человека из образцов биопсии. Этот протокол может быть использован для развития кардиологии или общих кардиологических исследований. Тем не менее, эти методы также обеспечивают различные полезные методы, которые могут быть применены к любому анализу тканей.

Для сбора эмбриональных день от 15 до 15,5 сердца, обеспечить конечности беременной плотины и, начиная вокруг уретры до грудины, тщательно сделать I-образный разрез вдоль туловища. Используя щипцы в черпая движении, нежно поднимите uterus из брюшной полости схватая поверхностные ткани uterus по мере необходимости с точной щипцы для того чтобы помочь в извлечении. Используйте ножницы, чтобы освободить матку от живота.

После замачивания матки в ледяной PBS, контактный орган в рассечение блюдо. Используя ножницы, разрежьте матку на отдельные секции, каждый из которых содержит отдельный эмбрион. Используя две пары тонких типсов, аккуратно вычистите эмбрионы из ткани матки и поместите их в новую чашку Петри, содержащую четыре градуса по Цельсию PBS-EDTA.

Чтобы собрать сердца, поместите блюдо под рассечение микроскопа и использовать две пары тонких типсов, чтобы распоставить эмбрион в положение на спине. После стабилизации доступа к груди, используйте острую точку второй пары тонких типсов, чтобы сделать разрез вдоль грудины эмбриона, простирающейся между ключицы до пупка. Делая очень тонкие и поверхностные разрезы, постепенно работая в направлении внутренней части грудной полости, откройте брюшную полость эмбриона.

Когда сердце просто становится видимым, использовать пару типсов, чтобы сжать туловище слегка coddled к грудной клетке, чтобы очистить ребра открытыми. Используя стороны одной пары типсов, аккуратно схватите легочные кровеносные сосуды, не отделяя ткань и вытащите сердце из полости. Очистите сердце в свежем PBS-EDTA в течение одной-двух минут, прежде чем исправить ткани в 4%Paraformaldehyde в течение 45 до 60 минут.

Затем мыть сердце три раза в течение 5 до 10 минут за стирку в PBS дополняется глицином. Перед хранением сердца в PBS при четырех градусах по Цельсию. Чтобы подготовить сердце к криозеции, поместите образцы в трубку 30% сахарозы и PBS при четырех градусах по Цельсию в течение 24 до 40 часов.

Когда сердца опустились на дно трубки, используйте Pasteur Pipette с измененным наконечником, чтобы тщательно передать каждое сердце к куску ворса свободной салфетки. После краткого высыхания воздуха поместите каждый образец в отдельные оптимальные формы температуры резки в желаемых ориентациях для секционирования. Погрузим ткани в оптимальную температурную среду без пузырьков.

Затем храните формы при 20 градусах по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем заморозить ткани при 80 градусах по Цельсию, по крайней мере за 24 часа до криозирования. Для получения криостата разделы образцов, использовать свежие оптимальной температуры резки среды приложить блок ткани интерес к патрон криостата и позволяют среде заморозить, пока она не является непрозрачной белой. Вставьте новое лезвие и отрегулируйте расстояние между блоком ткани и лезвием, чтобы позволить получить секции.

Обрезать блок на 10 микрометров ломтиками до тех пор, пока точка интереса не будет достигнута. Когда ткань может наблюдаться, используйте небольшую плоскую кисть, чтобы аккуратно потяните ломтик к стенду в непрерывном движении резки. После того, как ткань была полностью прорезана, используйте деталь кисти погладить ломтик вниз плашмя против сцены.

Держите раздел на месте в течение примерно 20 до 30 секунд, прежде чем удалить подробную кисть и закончить ломтик. Используйте обе кисти, чтобы аккуратно сгладить ломтик против стадии предотвращения любого прокатки и провести ткань разделе против сцены. Через 20-30 секунд переверните секцию и снова сровняйте ее со сценой, прежде чем поместить электростатически заряженный слайд достаточно близко, чтобы срез был привлечен и придерживался слайда без касания слайда к сцене.

Для оценки секций сердечной ткани на наличие распространенных пороков сердца, с помощью микроскопа, оснащенного камерой, получить изображения на 5 до 10X и 40X увеличения. Для анализа уплотнения сердечной мышцы откройте ткани, представляющие интерес в соответствующей программе анализа изображений, и установите изображение на 8-битное. Чтобы установить порог изображения, нажмите Изображение, Отрегулируйте и Порог и переместите верхнюю планку, чтобы настроить порог до тех пор, пока не будут выбраны только пиксели для фона.

Далее используйте инструмент выбора полигонов, чтобы нарисовать область интереса вокруг ткани, а затем нажмите Анализ, Установить измерения, площадь, и предел порога. Нажмите Анализ и Мера для измерения области выделенных пикселей, чтобы получить значение области отрицательного пространства. Чтобы измерить область всего интересного региона, щелкните Analyze, Set Measurements и отвестите предел порога.

Затем выберите Анализ и Измерение для измерения всей области выбранного региона интереса. Чтобы рассчитать площадь мышечной ткани, вычесть область отрицательного пространства из области области интересов. Затем разделите область мышечной ткани на область региона интересов, чтобы рассчитать уплотнение мышц и X.The окрашивание ломтиков тканей из собранных эмбриональных сердец, обеспечивает достаточно контраста, чтобы разработать края ткани, но не так темно, чтобы сделать клеточные особенности неотличимыми.

В этом репрезентативном анализе было отмечено, что уплотнение мышц значительно снижается в экспериментальных сердцах по сравнению с эмбрионами, которые развивались в неиспециализных условиях. Эти образцы являются ценными и требуют длительного времени для создания. Во время некропсии и криостата секции конкретно, убедитесь, что преднамеренное о каждом действии вы выполняете.

Сохранение тканей в Параформальдегиде поддерживает антигенную активность, позволяя использовать образцы для таких тестов, как окрашивание аминофлюоресцента, которые помогают выявить патологические причины, обнаруженные в ходе оценки морфологии. В нашей лаборатории мы получили количественное представление экспериментальных методов лечения, которые могут помочь нам определить, в какой степени различные методы лечения влияют на наши образцы. Параформальдегид может исправить любую ткань, к ней прикасается.

Позаботьтесь, чтобы всегда носить перчатки, чтобы свести к минимуму подвергаются кожи и работать в капюшоне пленки, когда работает с этим химическим веществом.