Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

Этот протокол позволяет оценить потенциальные морфологические изменения в нейронах и дендритных шипах, которые могут подчеркивать нейрохимические и поведенческие отклонения. Он уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям прояснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивной дисфункции. Начните с подготовки решения PVP в соответствии с рукописными указаниями.

Заполните трубки с PVP и оставить его на 20 минут. И изгнать его через другой конец с 10 миллилитров шприц. Смешайте 170 миллиграммов вольфрама микрокарьерных бусин с 250 микролитров хлорида метилена.

Затем тщательно вихрем подвески. Затем добавьте 6 миллиграммов липофильной DilC18(3)красителя в 300 микролитров хлорида метилена и вихря. Трубы 250 микролитров вольфрама шарик подвески на стеклянную горку.

Подождите, пока подвеска высохнет и добавьте 300 микролитров раствора красителя. После того, как сушеные, использовать бритву, чтобы разделить смесь на две 1,5 миллилитров центрифуги труб и заполнить трубки с водой. Sonicate смесь в водяной бане до однородной.

Убедившись, что наконечник sonicator лежит непосредственно на трубах. Смешайте две смеси в 15 миллилитров конической трубки. И sonicate еще на три минуты, убедившись, что не большие сгустки красителя покрытием бисера остаются.

После sonication, нарисуйте смесь в PVP покрытием трубки с 10 миллилитров шприц. И кормить трубки в подготовительной станции. Поверните трубку на одну минуту.

Аккуратно удалите всю воду с помощью шприца. Включите азотный газ и отрегулируйте поток азота примерно до 0,5 литра в минуту. Поверните трубку на станции подготовки и высушите ее азотом в течение 30 минут.

Снимите трубку со станции и разрежьте ее на 13-миллиметровые сегменты трубчатым резаком. Убедитесь, что крыса не реагирует на вредные раздражители и рефлексы отсутствуют. Затем закрепню его в положении на спине.

Сделайте разрез вдоль грудной линии. Разделим диафрагму и открой грудь ножницами. Затем вставьте 20 калибровочных 25 миллиметров иглы в левый желудочек.

Немедленно вырежьте правый атриум ножницами и прополка 15 миллилитров 100 миллимолейных PBS с 5 миллиметрами в минуту скорости потока. Затем пронизыть 100 миллилитров 4%PFA буфера в PBS. После перфузии, удалить весь мозг крысы.

И постфикс его с 4%PFA в течение 10 минут. Используйте матрицу мозга крысы, чтобы сократить 500 микрометров толщиной корональной секции. Сделать кулак вырезать и держать лезвие на месте.

Затем сделайте второй разрез вторым лезвием и вертикально удалите первое лезвие, удерживая ткань на поверхности лезвия. Поместите ломтики мозга в 24-хорошо пластины с 1 миллилитр PBS в каждом хорошо. И повторяйте процесс до тех пор, пока все ломтики не будут разрезаны.

Удалите PBS из каждого целевого хорошо. Загрузите хрящ куском тюбинга Dil/tungsten и поместите его в аппликатор. Положите лист фильтровальной бумаги между двумя сетчатыми экранами.

И подключите аппликатор к гелиевому шлангу. Затем отрегулируйте выходной у давления гелия до 90 фунтов на квадратный дюйм. Поместите аппликатор вертикально по центру целевого хорошо 1,5 сантиметра между образцом и сетчатым экраном.

Затем огонь Dil / вольфрама трубки. Загрузите хрящ с следующей трубки и непрерывно огонь бисера из труб на оставшиеся ломтики. Заполните 24-хорошо пластины с 100 миллимолярд PBS.

И мыть ломтики три раза с 500 микролитров свежих PBS. Убедившись, что ломтики не перевернуть во время мытья. После завершения, добавить 500 микролитров свежих PBS к ломтикам.

И инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию в темноте. После инкубации используйте тонкую кисть для переноса ломтиков мозга на стеклянные горки. И сразу же добавить один миллилитр антифада монтажа среды для каждого раздела.

Поместите 22 на 15 миллиметров крышки над секциями и высушите горки в темноте. Включите систему конфокального микроскопа и переключитесь на цель 60X. Отрегулируйте настройки изображения в соответствии с рукописными указаниями.

И получить изображения для целевого типа нейронов на основе границ области мозга и морфологических характеристик нейронов. Изолировать первичный корковой нейрон от F344/N крыс в послеродовой день один и культуры их в 35 миллиметров стекла нижней блюдо в течение одной недели. Освежает половину среды на третий день после изоляции.

Вымойте блюдо дважды с 1 миллилитр 100 миллимолярный PBS. И исправить клетки с 4%PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Баллистически обозначить клетки, как описано ранее.

И мыть их еще три раза с 1 миллилитр PBS. Добавьте 500 микролитров PBS в клетки и инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах Цельсия в темноте. Затем добавьте 200 микролитров антифадной крепления среды.

И получить изображения для каждого целевого нейрона. Типичные пирамидальные нейроны в области гиппокампа в секциях мозга крыс были идентифицированы с помощью технологии баллистической маркировки, характеризующейся одним большим апическим дендритом и несколькими меньшими базальными дендритами вокруг сомы. Программное обеспечение количественного анализа нейронной реконструкции использовалось для отслеживания дендритных ветвей и обнаружения шипов.

Впоследствии, программное обеспечение было использовано для оценки дендритных ветвлений сложности и нейрональной сложности беседки. Морфологические изменения в дендритных шипах оценивались с использованием длины, объема и диаметра головы. Затем шипы были классифицированы на тонкие, коренастые и грибные шипы.

И была изучена относительная частота количества шипов между каждым радиусом. Более того, метод баллистической маркировки был проверен на первичном пирамидавом нейроне в клеточной культуре. Пирамидальные нейроны были определены на основе формы треугольника сомы и большого апического дендрита.

Затем программное обеспечение для реконструкции нейронов было использовано для анализа распределения тонких дендритных шипов и длины дендритного позвоночника. При попытке этого протокола, важно, чтобы избежать больших скоплений или кластеров баллистического красителя покрытием вольфрама бусы начала подготовки. Clumps не позволит различать отдельные нейроны.

В сочетании с программным обеспечением для реконструкции нейронов этот метод позволяет исследовать нейронную и дендритную морфологию позвоночника в гиппокампе пирамидальных нейронов. Программное обеспечение для реконструкции нейронов использует алгоритм, чтобы предложить автоматическую классификацию дендритных шипов. Количественная оценка нескольких параметров нейронов дает возможность лучше понять механизм, лежащий в основе когнитивной дисфункции нейронов.