3D сфероидная модель для глиобластомы
9 апреля 2020 г.
Здесь мы описываем простой в использовании нашествие, чтобы провести гиобластому. Этот ассси подходит для глиобластомы стволовых клеток. Также описывается макрос Фиджи для легкой количественной оценки вторжения, миграции и распространения.
Двухмерные клеточные культуры не адекватно имитируют рост опухоли in vivo. Для улучшения, 3D процедуры были разработаны с использованием сфероидов. Наш 3D глиобластома сфероид основе анализа особенно хорошо подходит для расследования вторжения опухоли головного мозга в здоровой среде опухоли головного мозга.
Трехмерные модели культуры могут быть использованы для повторения многоклеточной архитектуры, неоднородности и метаболического состояния опухолей, позволяющих более тщательную оценку воздействия наркотиков. Будьте уверены, чтобы не коснуться нижней части хорошо или полностью удалить супернатант, чтобы держать гель на льду, и добавить клетки в гель быстро. Для генерации равномерного размера опухолевых сфероидов, сначала мыть опухолевых клеток культуры интереса с пятью миллилитров PBS и лечения клеток с 0,5 до одного миллилитра диссоциации фермента.
После пяти минут при 37 градусах по Цельсию, остановить реакцию с четырьмя до 4,5 миллилитров PBS и передачи отдельных клеток в 15 миллилитров конической трубки, содержащей 10 миллилитров полного роста среды. После подсчета, повторного использования клеток в один раз от 10 до шестой клетки на восемь миллилитров полного роста среды дополняется двумя миллилитров 2%метилцеллюлозы концентрации и передачи суспензии в стерильный контейнер системы. Затем добавьте 100 микролитров клеток в каждую колодец 96-хорошо круглой нижней пластины и поместите пластину в 37 градусов по Цельсию 5%углекислого газа инкубатор в течение трех-четырех дней.
Для выполнения анализа вторжения, когда опухолевые клетки сформировали равномерно размера сфероидов, передать каждую структуру клеток в 500 микролитер трубки и мыть сфероиды один раз с 200 микролитров PBS. После второй стирки тщательно перенесите сфероиды в 100 микролитров свежеприготовленной коллагеновой матрицы и добавьте каждую суспензию сфероида в центр каждого колодец плоской нижней 96-хорошо пластины. После 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию добавьте 100 микролитров полной среды роста поверх геля в каждую хорошо.
Не забудьте поместить все сфероиды в центре каждого хорошо для лучшего изображения вторжения опухолевых клеток. Для выполнения миграционного анализа, когда опухолевые клетки сформировали равномерного размера сфероидов, пальто шесть хорошо пластины с 0,2 миллиграмма на миллилитр Matrigel в среде роста в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации удалите Matrigel и добавьте два миллилитров полной среды роста к каждой хорошо.
Перенесите сфероиды из круглой нижней пластины в 50 микролитровых томов в отдельные скважины шести скважин и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день, пятно сфероидов с 10 нанограмм на миллилитр Hoechst в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию. Для получения изображений после вторжения или миграции анализа, поместите пластину на сцену Яркого поля конфокальный микроскоп оснащен видеокамерой и получить изображения в течение соответствующего экспериментального периода.
Чтобы проанализировать изображения в полуавтоматической манере, импортировать изображения на Фиджи и нажмите Плагины, Макрос, Интерактивный переводчик. Копировать и вставлять адаптированную фиолетовую петлю. Держите фиолетовые предложения и добавить зеленые предложения интерес по мере необходимости.
Затем, чтобы измерить область каждого сфероида, нажмите Анализ и измерения. Для измерения гипоксии в различных областях сферической структуры, углеродной ангидразы IX окрашивания могут быть использованы для определения гипоксической активности. В этом репрезентативном анализе, более углеродной ангидразы IX положительные клетки наблюдались в сфероидный центр.
Гипоксические клетки, расположенные в сфероидном ядре, как правило, более гликолитические, чем клетки, окружающие ядро. Митохондрии могут быть изображены с помощью электронной микроскопии для дальнейшего анализа. Диаметр сфероида напрямую коррелирует с плотностью клеток, которые составляют структуру 3D-клеток, и макросы Фиджи могут быть использованы для количественной оценки пролиферации, вторжения или миграции клеток внутри каждого сфероида или миграции клеток внутри каждого сфероида.
Увеличение сфероидного ядра отражает стимуляцию пролиферации клеток. При ингибировании комплекса I митохондриальной дыхательной цепи, подавляющее большинство производства АТФ в митохондриях скомпрометировано снижение пролиферации на 20% после 72 часов. Лечение хлорида водорода усиливает вторжение коллагена типа I в течение 24 часов, но уменьшает миграционную область сфероидов в 1,5 раза по сравнению с контролем необработанных сфероидов.
По оценке живой визуализации, сфероиды демонстрируют высокую внутреннюю динамику и быстро перемещаются. Размер сфероидов должен быть относительно однородным и следует позаботиться о том, чтобы манипулировать сфероидами к центру скважин для получения наилучших результатов визуализации. Этот метод может быть также использован для исследования пролиферации опухолевых клеток, миграции и смерти, а также выражения внеклеточной матрицы, клеточных рецепторов или внутриклеточных белков, представляющих интерес.
Сфероиды могут быть также инкапсулированы и эффект повышенного поверхностного напряжения клеток может быть исследован при удалении капсул.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод анализа инвазии на основе 3D-сфероидов глиобластомы, разработанный для стволоподобных клеток глиобластомы. Этот анализ позволяет исследовать инвазию опухоли в здоровую ткань мозга, обеспечивая более точное моделирование условий in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Традиционные 2D-культуры клеток неэффективно имитируют рост опухоли in vivo.
- Модели 3D-культивирования позволяют воспроизвести многоклеточную архитектуру и гетерогенность опухоли.
- Эти модели обеспечивают более точную оценку воздействия лекарственных препаратов на опухоли.
- Глиобластома представляет собой крайне агрессивную опухоль головного мозга с неблагоприятным прогнозом.
Цель исследования
- Разработать простой в использовании метод анализа для изучения инвазии глиобластомы.
- Предложить метод количественной оценки инвазии, миграции и пролиферации.
- Углубить понимание особенностей поведения глиобластомы в более физиологически релевантной среде.
Используемые методы
- Использование 3D-культур сфероидов клеток глиобластомы.
- Применение макроса Fiji для количественного анализа.
- Осторожное обращение с гелями и клетками для сохранения целостности анализа.
- Промывка и обработка клеток ферментами для диссоциации с целью формирования сфероидов.
Основные результаты
- Данный анализ успешно имитирует инвазию глиобластомы в здоровую ткань мозга.
- Методы количественного анализа предоставили надежные данные о поведении клеток.
- 3D-культуры обеспечили более эффективную оценку лекарственного ответа.
- Для получения стабильных результатов были созданы сфероиды однородного размера.
Выводы
- Разработанный метод анализа является ценным инструментом для исследования глиобластомы.
- Он позволяет получить представление о механизмах инвазии опухоли.
- Методология может быть адаптирована для различных экспериментальных условий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная 3D-модель сфероидов глиобластомы устраняет критический пробел в доклинической онкологии, предоставляя физиологически релевантную систему для изучения инвазии опухоли и ответа на лекарственную терапию. Она позволяет проводить более прогностическую оценку терапевтических кандидатов по сравнению с традиционными 2D-культурами, поддерживая раннюю валидацию мишеней и снижение механистических рисков в процессах разработки препаратов для нейроонкологии. Этот метод анализа улучшает трансляционную преемственность, связывая результаты in vitro с взаимодействиями в микроокружении опухоли, имитирующими условия in vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы инвазии опухоли и уточнять сигнальные пути в многоклеточной 3D-архитектуре.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью количественных показателей инвазии и миграции сфероидов.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность гипотез относительно мишеней за счет моделирования действия препаратов в релевантной системе заболевания, которая воспроизводит гетерогенность опухоли.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение стандартизированных сфероидов однородного размера для воспроизводимого скрининга соединений и оценки зависимости «доза-эффект».
- Практическая ценность: позволяет внедрять рабочие процессы, совместимые с высокопроизводительным анализом, с использованием 96-луночных планшетов и полуавтоматического анализа изображений с помощью макросов Fiji.
- Готовность метода: обеспечивает получение количественных данных о пролиферации, инвазии и миграции, что способствует валидации анализа и воспроизводимости результатов между различными лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует формирование гипоксического ядра и метаболических градиентов, наблюдаемых в опухолях пациентов, что повышает значимость биомаркеров.
- Практическая ценность: Облегчает проведение исследований по совместному культивированию со стромой или модуляции внеклеточного матрикса (ECM) для изучения взаимодействий между опухолью и стромой в контролируемой среде.
- Трансляционная преемственность: Поддерживает принятие решений о переходе к следующим этапам разработки с учетом рисков путем установления связи между данными об инвазии in vitro и профилями доклинической эффективности и безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ интегрируется в общий процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, предоставляя систему, релевантную конкретному заболеванию, для механистического скрининга и фенотипической оценки перед проведением исследований in vivo.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о факторах инвазии и стромальных взаимодействиях в 3D-модели глиобластомы.
- Скрининг: Позволяет проводить стандартизированную и воспроизводимую оценку влияния соединений на размер сфероидов, площадь инвазии и миграционную способность.
- Аналитика: Предоставляет количественные показатели посредством анализа изображений (например, диаметр сфероида, гипоксическое ядро, фронт инвазии) для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой путем моделирования особенностей микроокружения опухоли, таких как гипоксия и ремоделирование ECM.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения глиобластомы и, потенциально, других типов опухолей ЦНС, сокращая необходимость в избыточной разработке моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в путях инвазии опухоли.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным протоколам формирования сфероидов и визуализации.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), обеспечивая более раннее и биологически прогностическое получение данных об эффективности соединений.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов на основе анализа рисков, исходя из фенотипов инвазии и пролиферации в 3D-модели заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с 3D-культурами клеток, владение методами стерильной работы и конфокальной микроскопии для стабильного манипулирования сфероидами и их визуализации.
- Необходим доступ к коллагеновому матриксу, Matrigel, ферментам для диссоциации и 2% метилцеллюлозе для формирования сфероидов и проведения анализов инвазии.
- Требуются стандартизированные рабочие процессы анализа изображений (например, макросы Fiji) для обеспечения количественной согласованности данных между разными пользователями и центрами.
- Необходим строгий контроль температуры и времени при приготовлении геля и встраивании сфероидов для сохранения целостности анализа.
- Ограничением является необходимость обеспечения однородного размера сфероидов и предотвращения их контакта с дном лунки для получения надежных результатов измерения инвазии и миграции.
