Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Мы используем этот анализ, чтобы оценить, содержит ли растительная пища фитостериоды, которые могут влиять на физиологические процессы у животных, а также на поведение и репродуктивный успех. Этот анализ обеспечивает простой и надежный метод определения того, продуцируют ли растения эстрогенные соединения с биологической активностью. Этот метод был первоначально разработан для скрининга препаратов с активностью ксеноэстрогена для применения в медицине.

Например, ингибирование пролиферации клеток. Мы используем его, чтобы дать представление об экологии и эволюции приматов. Перед проведением этого анализа важно попрактиковаться в работе с асептической техникой в чистой среде, так как она очень чувствительна к загрязнению.

Начните с сублимационной сушки свежих растительных продуктов с помощью лиофилизатора, затем тонко измельчите их с помощью мельницы с сетчатым сеткой 0,85 мм. Храните измельченные образцы в мешках в темноте до извлечения. Чтобы извлечь любые потенциальные фитостероиды в растениях, добавьте высушенный образец в колбу соответствующего размера, а затем в метанол класса ВЭЖХ.

Накройте раствор растительного метанола алюминиевой фольгой и установите его вращать со скоростью 100 об/мин в течение трех дней на орбитальном шейкере. Через три дня с помощью фильтровальной бумаги сцедите супернат и поместите его в систему капельной фильтрации. Высушите растительный экстракт с помощью ротационного испарителя до тех пор, пока он не загустеет, но может быть перелит в колбу с круглым дном объемом 300 миллилитров.

Налейте образец в колбу объемом 50 миллилитров и промойте большую колбу небольшим количеством метанола, затем продолжайте сушить образец в маленькой колбе до полного испарения метанола. Когда закончите, взвесьте остатки образца с помощью аналитических весов и запишите массу. Растворите растительный экстракт в ДМСО в концентрации 0,1 грамма экстракта на два миллилитра ДМСО и перемешайте его до гомогенизации.

ДМСО не токсичен сам по себе, но это транспортное средство, которое позволяет другим веществам проникать через мембраны. Поскольку мы не знаем, содержат ли наши растения токсичные химические вещества, все они рассматриваются как опасные. Не допускайте контакта раствора с кожей, замените перчатки при загрязнении, а также носите плотную обувь с плотными носками и лабораторные халаты.

Храните образец при температуре четыре градуса Цельсия во флаконах из янтарного стекла до тех пор, пока он не будет готов к использованию. Обработайте образцы вихрем, затем добавьте четыре микролитра каждого образца к 496 микролитрам составной среды для скрининга, чтобы получить 0,8% раствор ДМСО. Продезинфицируйте внешнюю поверхность предварительно нагретой пробирки для восстановления клеток 70% этанолом и перелейте 10 миллилитров среды в пробирку с замороженными репортерными клетками, чтобы разморозить их.

Закройте трубку с репортерными ячейками и поместите ее на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на пять-10 минут. После извлечения клеток из водяной бани осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы разбить агрегаты клеток и получить однородную суспензию, затем очистите поверхность пробирки 70% этанолом. С помощью многоканальной пипетки дозируйте 100 микролитров суспензии репортерных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, затем диспонируйте 100 микролитров образцов в трех экземплярах в соответствующие лунки.

Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 22-24 часов. Непосредственно перед окончанием инкубации планшетов извлеките подложку для обнаружения и буфер обнаружения из холодильника и поместите их в место с низким уровнем освещенности, пока они не уравновесятся до комнатной температуры, затем осторожно переверните каждую пробирку, чтобы перемешать растворы. Непосредственно перед завершением инкубации планшета вылейте все содержимое буфера для детектирования в пробирку с субстратом для детектирования для создания реагента для обнаружения люциферазы.

Аккуратно перемешайте тюбик, чтобы не образовалась пена. Выбросьте содержимое планшета с образцом в неподходящий контейнер для отходов и аккуратно постучите им по чистому впитывающему бумажному полотенцу, чтобы удалить последние капли из лунок. Добавьте 100 микролитров реагента для обнаружения люциферазы в каждую лунку и дайте анализной пластине отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут, затем количественно оцените люминесценцию с помощью 96-луночного люминометра.

22 экстракта фруктов и овощей, обычно встречающихся в рационе человека, были проверены на наличие эстрогенных соединений. Эстрогенная активность представлена в порядковом качественном порядке высокой, средней, низкой или нулевой активности. Органические и неорганические соевые бобы были проверены на высоком уровне активности, в то время как все остальные фрукты и овощи не показали активности.

Сравнение результатов соевых бобов со стандартной кривой также показывает, что они имеют высокий уровень эстрогенной активности при этой концентрации. Экстракт соевых бобов, известный мощный источник изофлавонов, даидзеина и генистеина, был дополнительно использован для определения разведения, дающего максимум 50% сигнала. Этот экстракт требует в 422 раза большего разведения, чтобы получить в два раза меньше сигнала по сравнению с нашим стандартным протоколом разведения.

Образцы, идентифицированные с активностью, могут быть отправлены на анализ с помощью масс-спектрометрии для идентификации активных химических веществ. Используя метод антагонистов, мы также могли бы определить, содержит ли растительная пища химические вещества, которые снижают связывание и активность эндогенных эстрогенов. Этот метод позволяет нам углубить наше понимание того, насколько эстрогенные продукты преобладают в рационе приматов, а также как потребление фитоэстрогенов влияет на физиологию и поведение, когда анализ сочетается с анализом фекальных гормонов и полевыми данными.