Высокая пропускная способность Дрожжи Штамм Фенотипирование с капли на основе РНК секвенирования
21 мая 2020 г.
Узким местом в цикле микробной инженерии «дизайн-сборка» является скорость, с которой мы можем выполнять функциональные экраны штаммов. Мы описываем метод высокой пропускной способности для скрининга штамма применяется к сотням тысяч дрожжевых клеток в эксперименте, который использует капли на основе РНК секвенирования.
ICO, или ICO-seq, является первой адаптацией секвенирования РНК с высокой пропускной способностью к микробам. Этот метод оценивал микробную функцию в масштабах всего генома. Для инженерных микробов этот метод может прояснить, как изменения в геноме микробов могут возмущать его функции.
Получить дрожжи из культуры суспензии, и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра. Повторно приостанавливать клетки в PBS с концентрацией около 750 000 клеток на миллилитр. Затем смешайте сверхнизкие точки плавления агарозы в PBS и нагрейте смесь при температуре 90 градусов по Цельсию, пока агароза не растает.
Загрузите смесь агарозы в шприц с прикрепленным фильтром 0,22 микрона. Поместите шприц-насос перед обогревателем, установленным до 80 градусов по Цельсию, и поместите шприц в насос. Заполните второй шприц с дрожжевой суспензией, и заполнить третий шприц с фторированным маслом, с 2%ionic флюоросурфактант.
Загрузите оба шприца в шприц-насосы. Соедините трубки из шприцев с устройством A.Place 15-миллилитровую коническую трубку в ведро со льдом и направляем розетку в коническую трубку. Установите скорость потока для каждого шприца, и собрать примерно один миллилитр эмульсии в 15 миллилитров конической трубки.
После ожидания пять минут для агарозы в трубке, чтобы установить, добавить равный объем 20% перфторо-октанола в фторированном масле эмульсии. Смешайте эмульсию и перфторо-октанол, инвертировать коническую трубку несколько раз. Центрифуга сломанной эмульсии на 2000 раз G в течение двух минут.
Убедитесь, что гидрогели гранулированы над фазами масла и ПФО. Удалите фазы масла и ПФО. Добавьте два миллилитров tet (W)буфера, чтобы повторно приостановить гидрогели.
Перенесите подвеску в новую 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки снова на 2000 раз G в течение двух минут. Удалите супернатант и снова приостановите гидрогели в тет(W).
После вращения вниз гидрогели на 2000 раз G в течение двух минут, повторно приостановить гидрогели в двух миллилитров дрожжевой культуры среды. Инкубировать трубку на ночь при 30 градусах по Цельсию, с тряской. Каждый штамм растет с разной скоростью.
Выбор соответствующих средств массовой информации и инкубации время имеет важное значение для обеспечения того, чтобы дрожжи растут в гидрогеле, но не перерастают, что приводит к клеткам побега в средствах массовой информации. Во-первых, перенесите гидрогели в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки на 2000 раз G в течение двух минут.
Вымойте гидрогели дважды с PBS, а затем один раз в буфер сферопластизации. Выполните 40-х разбавление фермента сферопластизации в буфере сферопластизации. Затем добавьте один миллилитр разбавленного фермента в гидрогели.
Инкубировать трубку гидрогеля при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Обработанные дрожжи будут выглядеть более прозрачными. Из трубки, содержащей гидрогелевую подвеску, свяжете 0,8 миллилитров суспензии со дна трубки и перенесите ее в одноми миллилитр необнамещенный шприц.
Поместите шприц в держатель шприца с 3D-печатью. Центрифуга шприц и держатель на 2000 раз G в течение двух минут. Прежде чем приступить, убедитесь, что гидрогели плотно упакованы в нижней части шприца.
Поместите 240 000 бусинок drop-seq в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга трубки в 1000 раз G в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно приостановите бисер в двух миллилитров 0,9x буфера дрожжевого лиза, с 500 миллимолярный хлорид натрия.
Вставьте бар для перемешивания и перенесите подвеску шарика в трехми миллилитровый шприц. Приготовьте еще один шприц, содержащий несколько миллилитров сурфактанта PFPE-PEG в фторированном масле. Получить ранее подготовленный шприц дрожжей клон упакованы гидрогели.
Эвакуируйте голову согласия и крышка шприца. Вставьте три шприца, гидрогели, подвеску шарика и масло в шприц-насосы. Подключите шприцы через трубки к устройству B, инкапсуляционное устройство.
Поместите конец розетки трубки в 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Установите скорость потока для каждого шприца. Соберите около 1000 миллилитров эмульсии, или запустите устройство до тех пор, пока не осталось гидрогеля.
Затем следуйте протоколу drop-seq для синтеза cDNA, подготовки библиотеки и секвенирования. Используя микрофлюидное устройство, дрожжевые клетки инкапсулировались в 160-микрометровых каплях. Восьмикратный сплиттер разделил эти капли на восемь 60-микрометрных капель.
Ночная инкубация привела к тому, что изогенные дрожжевые колонии росли в некоторых гидрогелях. Перед загрузкой дрожжевых гидрогелей во второе микрофлюидное устройство их промыли и погрузили в раствор для переваривания клеточных стенок. Правильное пищеварение было проверено с помощью микроскопии, с обработанными дрожжевых клеток, имеющих более отражающей морфологии.
Поток шариков захвата мРНК в буфере лиза был смешан с потоком гидрогеля дрожжей близкого пакета до соединения второго микрофлюидного устройства. В результате эмульсии, около 10% собранных капель содержали один шарик с лизаной колонией. Этот изогенный рабочий процесс последовательности колонии был использован для анализа белой непрозрачной реакции переключения C.albicans.
Основной компонент, ПК, анализ и уменьшение размерности tSNE указывают на общее согласие между набором выборочных данных и набором справочных данных. Анализ TSNE выявил три кластера клеток. В то время как кластер два в основном состоял из ячеек из набора выборочных данных, кластеры ноль и один состоял из ячеек из обоих образцов.
Наложение выражения WH11 на tSNE указывает на то, что кластер один, вероятно, содержал белые колонии. Выражение STF2 увеличилось в кластере один, в соответствии с ранее полученными данными. В кластерах ноль и два, WH11 и STF2 были значительно вниз регулируется по сравнению с кластером 1.
Андрогенные микробы имеют все возрастающий потенциал для массового производства биопрепаратов для лечения широкого спектра заболеваний. После этой процедуры можно применить различные биоинформатические инструменты для дальнейшего анализа данных секвенирования.
Обзор
В данном исследовании представлен высокопроизводительный метод скрининга штаммов в микробной инженерии, в частности с использованием секвенирования РНК на основе капелек для анализа клеток дрожжей. Метод позволяет проводить функциональную оценку модифицированных микроорганизмов в масштабе всего генома.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробная инженерия
- Высокопроизводительный скрининг
- Секвенирование РНК
Теоретические сведения
- Функциональный скрининг микробных штаммов часто бывает медленным и неэффективным.
- Методы высокопроизводительного анализа позволяют значительно увеличить скорость таких оценок.
- Секвенирование РНК на основе капелек представляет собой новый подход к оценке функций микроорганизмов.
- Понимание пертурбаций генома может помочь в разработке стратегий микробной инженерии.
Цель исследования
- Разработать метод быстрого скрининга штаммов дрожжей с использованием секвенирования РНК.
- Выявить функциональное влияние геномных изменений в модифицированных микроорганизмах.
- Повысить эффективность цикла «проектирование-сборка-тестирование» (design-build-test) в микробной инженерии.
Используемые методы
- Клетки дрожжей культивировали и подготавливали до определенной концентрации.
- Для инкапсуляции дрожжевых клеток использовали микрофлюидику на основе капель.
- Для оценки экспрессии генов инкапсулированных клеток проводили секвенирование РНК.
- Для анализа данных секвенирования применяли биоинформатические инструменты.
Основные результаты
- Данный метод позволил успешно инкапсулировать клетки дрожжей в капли для высокопроизводительного анализа.
- Были созданы изогенные колонии, в которых анализировали паттерны экспрессии генов.
- Метод главных компонент выявил отчетливые кластеры экспрессии генов.
- Результаты указали на значительные различия в экспрессии генов, связанные с морфологией колоний.
Выводы
- Этот высокопроизводительный метод расширяет возможности эффективного скрининга микробных штаммов.
- Полученные данные могут быть использованы при последующей инженерии микроорганизмов для биотехнологического применения.
- Данный подход применим к различным видам микроорганизмов, помимо дрожжей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Несмотря на достижения в области редактирования генома, высокопроизводительный скрининг штаммов по-прежнему остается узким местом в микробной инженерии. Данный метод секвенирования РНК на основе капель позволяет проводить функциональную оценку модифицированных штаммов дрожжей в масштабе всего генома, напрямую решая проблему компромисса между объемом получаемой информации и пропускной способностью. Обеспечивая вывод фенотипических характеристик на основе транскрипционных профилей, этот метод повышает достоверность прогнозирования при выборе штаммов и ускоряет цикл «проектирование — создание — тестирование» для производства биопрепаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая геномные модификации с функциональными фенотипами с помощью полнотранскриптомного анализа.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет количественного профилирования экспрессии генов, которое проясняет влияние генетического редактирования на уровне сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: упрощает отбор приоритетных проектов в портфеле путем идентификации штаммов с искомыми профилями экспрессии, связанными с целевыми путями, что снижает зависимость от низкопроизводительных методов анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: обеспечивает получение стандартизированных изогенных колоний дрожжей, инкапсулированных в капли, которые подходят для воспроизводимого фенотипического скрининга на основе RNA-seq.
- Масштабируемость: позволяет параллельно обрабатывать тысячи генетически различных штаммов, преодолевая ограничения традиционного метода пикирования колоний и методов на основе массивов.
- Качество данных: обеспечивает получение количественных мультиплексных измерений экспрессии генов, что позволяет проводить надежное сравнение библиотек штаммов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Применимо к переключению Candida albicans между белым и опалесцирующим фенотипами (white-opaque switching), который связан с вирулентностью, что демонстрирует полезность метода для характеристики патогенных штаммов.
- Трансляционная преемственность: Связывает генетические модификации с фенотипическими результатами с помощью биомаркеров экспрессии (например, WH11, STF2), что способствует отбору штаммов на основе соответствующих биомаркеров.
- Снижение доклинических рисков: Обеспечивает раннее выявление нефункциональных или аберрантных штаммов, снижая риск неудач на последующих этапах разработки.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы инженерии микробных штаммов — от создания библиотек до функциональной валидации, обеспечивая приоритезацию штаммов на основе данных транскриптома перед идентификацией наиболее перспективных вариантов.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез, выявляя влияние геномных пертурбаций на глобальную экспрессию генов в изогенных фонах.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, готовые к анализу микробные системы с воспроизводимыми результатами транскрипции для тестирования отклика на соединения или условия.
- Аналитика: обеспечивает получение кластеров экспрессии на основе PCA и tSNE, а также наложение маркерных генов, что позволяет проводить фенотипическую классификацию и сравнение штаммов.
- Трансляционные исследования: связывают генотипы штаммов с фенотипическими состояниями через консервативные маркеры, обеспечивая непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для скрининга библиотек штаммов дрожжей и других микроорганизмов в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования взаимосвязей между штаммом и его функцией за счет снижения механистической неопределенности с помощью данных об экспрессии в масштабе всего генома.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет микрофлюидного инкапсулирования и контролируемого роста колоний в гидрогеле.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и оптимизирует распределение капитала за счет возможности экспресс-оценки штаммов по нескольким параметрам.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков путем раннего выявления штаммов с молекулярными профилями, указывающими на желаемые фенотипы.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области микрофлюидики, генетики дрожжей и подготовки библиотек для секвенирования РНК единичных клеток.
- Зависит от наличия устройств для генерации капель, фторированных масел, поверхностно-активных веществ, а также инфраструктуры для последующего секвенирования и биоинформатического анализа.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов приготовления гидрогеля, сферопластирования и связывания с бусинами для получения воспроизводимых результатов.
- Требует оптимизации времени инкубации и состава среды для предотвращения избыточного разрастания гидрогеля и выхода клеток, что зависит от используемого штамма.
- Ограничено необходимостью наличия транскрипционных биомаркеров с известными фенотипическими ассоциациями для обеспечения точного вывода фенотипа на основе данных RNA-seq.
