Обратная транскрипция петли-опосредованное Изотермальная усиление (RT-LAMP) Ассадля для специфического и быстрого обнаружения вируса озера Тилапия
18 мая 2020 г.
Мы представляем RT-LAMP анализ для обнаружения TiLV в тилапии рыбы с использованием простых инструментов в течение относительно короткого периода времени по сравнению с обычными методами RT-PCR. Этот протокол может помочь в борьбе с эпидемическим распространением TiLVD, особенно в развивающихся странах.
Вирус озера Тилапия является новым вирусом и инфекционными патогенами, которые вызывают высокую смертность в тилапии и ее гибридных видах. Поскольку тилапия является основным источником белка для многих развивающихся стран, новая вирусная инфекция оказывает большое влияние на аквакультуру тилапии, а также угрожает мировой продовольственной безопасности. Разработка быстрого, точного и чувствительного метода обнаружения вируса в тканях рыб поможет борьбе с болезнью и уменьшить воздействие вируса.
В этом видео мы покажем обратную транскрипцию опосредованного изотермального усиления, или анализ RT-LAMP, для быстрого обнаружения вируса озера Тилапия в образцах рыб. Часть 2, добыча РНК. Во-первых, добавить 3250 миллиграммов ткани печени в стерильные 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, содержащие от 600 до 1000 микролитров кислоты гуанидиния фенола базовый реагент, и фарш до однородной.
Центрифуга на 10 000 RCF в течение 30 секунд, и передать супернатант в новую трубку. Добавить равный объем 95% этанола в трубку, и тщательно перемешать. Перенесите раствор в спиновую колонку, помещенную в трубку для сбора, затем центрифугу на 10 000 RCF в течение 30 секунд.
Отбросьте поток через, и передать колонку в новую трубку сбора. Добавьте 400 микролитров РНК PreWash в столбец и центрифугу при 10 000 RCF в течение 30 секунд. Отбросьте поток через, и повторить этот шаг.
Добавьте 700-микролитерный РНК Wash Buffer в столбец и центрифугу при 10 000 RCF в течение двух минут. После этого перенесите колонку в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Наконец, elute РНК в колонке матрицы с 100-микролитер, нуклеазы свободной воды, и центрифуги на 10000 RCF в течение 30 секунд.
Часть три, грунтовка дизайн. PrimerExplorer Версия 4 является наиболее распространенным инструментом биоинформатики для разработки эффективных LAMP, или RT-LAMP грунтовки, в которых хорошие руководства для программного обеспечения доступны на их сайте. Здесь, четыре конкретных грунтовки, состоящие из двух внутренних и двух внешних грунтовки, были разработаны, чтобы признать шесть различных регионов в сегменте 3 TiLV, возникла из Таиланда.
После входа на веб-сайт, где ссылка отображается в видео, нажмите на PrimerExplorer V4. Выберите файл, содержащий последовательность сегмента 3 TiLV, в формате FASTA, извлеченный из номера с доступом к GenBank, KX631923, или тилапийского озера вирус TV1 сегмент 3, а затем нажмите кнопку Primer Design. После нажатия кнопки Generate программное обеспечение будет обрабатываться, и результаты будут показываться. После оптимизации последовательностей для усиления LAMP, в общей сложности, одна пара внешних грунтовок, и две пары внутренних грунтовки, были выбраны для этого исследования, чтобы обнаружить инфекцию TiLV.
Этот набор грунтовок показан здесь. Часть 4, демонстрация RT-LAMP. Мастер-микс для RT-LAMP, специфичный для вируса озера Тилапия, состоит из следующих химических веществ.
Подготовьте мастер-микс с использованием химических веществ, показанных в таблице. Выпределите 22 микролитров мастер-микса в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Затем добавьте три микролитров шаблона РНК в реакционной трубке.
Для отрицательного контроля используйте дистиллированную воду вместо РНК-материалов и хорошо перемешайте. Инкубировать реакции при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После инкубации в течение 30 минут, калорийные изменения визуально наблюдаются невооруженным глазом.
Там, где это уместно, мы можем подтвердить результаты анализа RT-LAMP, выполняя гель электрофорез на 1,5%агарозный гель, работает со 100-Вольт постоянной, в течение 40 минут, в результате которого одна килобаза-пара молекулярного размера ДНК Лестница загружается вместе в качестве маркера для определения размера фрагмента. Часть 5, репрезентативные результаты и толкование. После инкубации в течение 30 минут реакция флуоресценции зерна, предполагающая положительное усиление TiLV в тканях рыб, очевидно, наблюдалась в зараженных образцах под ультрафиолетовым светом на длине волны 365 нанометров, в то время как те из отрицательного контроля имели четкий и слегка бесцветный раствор.
Соответственно, усиление продуктов RT-LAMP было подтверждено на электрофорезе агарозного геля, показывая различные размеры множественных усилений перевернутых повторов ДНК, образуя структуры стволовой петли под УЛЬТРА-лампой в образцах, зараженных TiLV, в то время как в колодцах отрицательного контроля, где результаты были в соответствии с результатами анализа RT-LAMP, не было. Таким образом, чтобы уменьшить распространение вируса озера Тилапия, немедленный скрининг этих инфицированных рыб, используя эффективно диагностический метод, является одним из важных ключей. Таким образом, недавно разработанный анализ RT-LAMP должен предложить быстрый и чувствительный диагностический инструмент, который будет применяться в процессе измерения биобезопасности.
Анализ может быть использован либо в лаборатории, либо на месте объектов. Мы надеемся, что этот метод будет внедриться для проверки популяции инфицированных рыб, что может привести к сокращению распространения вируса озера Тилапия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен экспресс-метод RT-LAMP для обнаружения вируса озера тиляпии (TiLV) у рыб семейства тиляпий, который является более быстрой альтернативой традиционным методам RT-PCR. Данный протокол предназначен для содействия в контроле распространения TiLV, особенно в развивающихся странах, где тиляпия является жизненно важным источником белка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Аквакультура
- Обнаружение патогенов
Теоретические основы
- Вирус озера тиляпии представляет собой контагиозный патоген, вызывающий высокую смертность у тиляпии.
- Данный вирус несет значительную угрозу для аквакультуры тиляпии и глобальной продовольственной безопасности.
- Существующие методы детекции часто трудоемки и сложны.
- Метод экспресс-диагностики имеет решающее значение для эффективного контроля заболевания.
Цель исследования
- Разработать быстрый и чувствительный метод обнаружения TiLV в тканях рыб.
- Снизить воздействие TiLV на аквакультуру тиляпии.
- Предложить практическое решение для борьбы с заболеванием в развивающихся странах.
Используемые методы
- Анализ методом обратной транскрипции и петлевой изотермической амплификации (RT-LAMP).
- Экстракция РНК из тканей печени тилапии.
- Использование простых инструментов для экспресс-тестирования.
- Сравнение с традиционными методами ОТ-ПЦР.
Основные результаты
- Метод RT-LAMP обеспечивает быстрое и точное обнаружение TiLV.
- Данный метод проще и быстрее, чем традиционный RT-PCR.
- Он может быть внедрен в условиях ограниченных ресурсов.
- Данный протокол может помочь сдержать распространение TiLV в популяциях тиляпии.
Выводы
- Метод RT-LAMP является перспективным инструментом для обнаружения TiLV.
- Он способствует усилиям по контролю заболевания в аквакультуре.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения в различных условиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрое и специфическое обнаружение новых вирусных патогенов, таких как вирус озера тиляпии (TiLV), имеет решающее значение для защиты аквакультуры и глобальной продовольственной безопасности. Анализ RT-LAMP позволяет своевременно выявлять инфекцию TiLV в тканях рыб, что способствует раннему вмешательству и реализации мер биобезопасности. Данный подход снижает зависимость от трудоемких молекулярных методов и облегчает масштабируемый скрининг в условиях ограниченных ресурсов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает специфическое обнаружение РНК TiLV, помогая подтвердить наличие вирусной мишени в инфицированных тканях организма-хозяина.
- Практическая ценность: предоставляет метод быстрой изотермической амплификации, не требующий оборудования для термоциклирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение визуальных или флуориметрических данных в течение 60 минут, что позволяет быстро оценить наличие вируса.
- Практическая ценность: требует минимального использования оборудования и может быть развернуто в полевых или лабораторных условиях для высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует применимость к нелетальным типам образцов, таким как слизь, что позволяет проводить лонгитюдный мониторинг вирусной нагрузки.
- Практическая ценность: позволяет проводить лонгитюдные исследования на животных моделях без жертвования подопытных животных, что улучшает дизайн эксперимента и снижает вариабельность данных.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод RT-LAMP вписывается в континуум научных открытий, предоставляя инструмент диагностики, который может быть развернут после формулировки гипотезы и перед проведением исследований по терапевтическому или профилактическому вмешательству.
- Фундаментальная биология: облегчает подтверждение наличия вируса в биологических образцах, поддерживая исследования механизмов патогенеза TiLV.
- Скрининг: позволяет быстро оценить статус инфицирования в когортах образцов, повышая готовность анализа для оценки противовирусных соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественные или полуколичественные результаты посредством визуальной оценки мутности, флуоресценции или гель-электрофореза, что способствует сравнительному анализу.
- Трансляционные исследования: поддерживают преемственность от первичного обнаружения до доклинической оценки стратегий вмешательства на соответствующих моделях заболеваний.
- Практическое применение: представляет собой модульную платформу детектирования нуклеиновых кислот, адаптируемую для других новых патогенов в системах аквакультуры или животноводства.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени за счет специфического и чувствительного обнаружения вирусной РНК.
- Операционная ценность: обеспечивает совместимость с условиями оказания медицинской помощи в месте нахождения пациента без использования специального оборудования; результаты можно считывать невооруженным глазом или с помощью простого трансиллюминатора.
- Стратегическая ценность: сокращает время получения результата при скрининге на инфекции, что позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении этапов исследования.
- Влияние на портфель проектов: улучшает оценку рисков в доклинических программах, предоставляя надежные данные о статусе инфекции, что снижает влияние вмешивающихся факторов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной биологии и дизайна праймеров для анализов на основе LAMP.
- Необходим доступ к наборам для экстракции РНК, водяной бане или термоблоку, а также к средствам визуализации (например, УФ-лампе или аппарату для гель-электрофореза).
- Требуется стандартизация протоколов подготовки образцов различных типов тканей (например, печени, слизи) для получения воспроизводимых результатов.
- Предусматривает валидацию специфичности анализа в отношении родственных патогенов для предотвращения ложноположительных результатов.
- Возможные ограничения связаны с необходимостью оптимизации наборов праймеров и потенциальным ингибированием сложными биологическими матрицами.
