Количественная оценка норовируса человека, как частицы, связывающиеся с commensal бактерий использованием потока цитометрии

Вирус-бактериальные взаимодействия могут иметь важное значение для успешной вирусной инфекции и стимуляции иммунного ответа хозяина. Но в настоящее время высококонцентрированные и очищенные запасы человеческого норовируса не могут быть произведены в лаборатории. Этот метод может быть использован с любым вирусом, который связывается с бактериями, для которых либо вирус, как частицы или живой вирус доступны.

Это позволяет нам количественно взаимодействия между этими вирусами и бактериями. Прививка пяти миллилитров жидкой среды с одной изолированной колонией Энтеробактер клоакэ из агарной пластины прямо из замороженного запаса глицерола. Выращиваем бактерии в одночасье.

На следующий день перенесите 1,3 миллилитровые алициты культуры в две отдельные 1,5 миллилитровые центрифуги. Центрифуга труб при 10 000 х г в течение пяти минут. Удалить supernatants, а затем мыть образцы в два раза с помощью одного миллилитра стерильных 1X PBS для каждой стирки.

Центрифуга образцов снова на 10000 х г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 1,3 миллилитров стерильных 1X PBS. Начиная с 0,5 миллилитров промытой культуры, последовательно разбавляют бактерии в 1X PBS от 10 до минус 1 до 10 до минус четырех.

Используя спектрофотометр, измерьте оптическую плотность промытой неразбавленной культуры и каждое из четырех разбавлений на 600 нанометров. Выполните 10-кратное серийное разбавление в 1X PBS для каждого из предыдущих разбавлений. Распространение 100 микролитров из последних трех разбавлений для каждой серии на агар пластины для определения количества колонии формирования единиц на миллилитр для каждого образца.

Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре в течение пяти минут. Переверните пластины и инкубировать их в инкубаторе. После подготовки реагентов, антител и бактерий, описанных в рукописи, собрать все материалы в шкаф биобезопасности BSL-2.

Вирус-как частицы для человека норовирус перечислены в качестве патогенов BSL-2 и все работы, выполняемые с использованием VLP должны быть проведены в сертифицированном кабинете биобезопасности. Добавьте 10 микрограммов вируса человека VLPs к каждой трубке бактерий и тщательно перемешать с помощью пипетки. Инкубировать трубки в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию с постоянным вращением.

После инкубации центрифуга трубки на 10 000 х г в течение пяти минут. Аспират и отказаться от супернатанта и повторно бактериальной гранулы в один миллилитр PBS. Повторив шаги мытья один раз, центрифуга труб снова на 10000 X г в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы VLP-бактерий в 150 микролитров 5%блокирующего буфера. Распространенная ошибка, которая происходит в том, что трубки меняются и неправильное лечение добавляется. Чтобы предотвратить это, расположить все трубы в линиях, которые соответствуют правильной обработки и добавить одну обработку все сразу в трубы.

Для каждого бактериального образца приготовьте 50 микролитров разбавленного человеческого норовируса GII антител. Используя 5%блокирующий буфер, разбавляйте антитела от одного до 125 для образцов E.cloacae. Приготовьте 50 микролитров разбавленного изотипного антитела для каждого бактериального образца с использованием одинаковых коэффициентов разбавления.

Разделите каждый образец анализа вложений на 350 микролитровых алицитов, переведя их в чистые 1,5 миллилитровые центрифуги. Чтобы создать неоплитаемые элементы управления, добавьте 50 микролитров блокирующего буфера к первой алиците из каждого бактериального образца. Для окрашенных образцов добавьте 50 микролитров разбавления антител GII во второй набор алицитов.

Создайте элементы управления изотипом, добавив 50 микролитров разбавленного изотипного антитела к третьему набору алицитов. Инкубировать все образцы на льду и в темноте в течение 30 минут. Затем центрифуга всех образцов на 10 000 X г в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатантов и перерасходуйте каждый образец в 150 микролитров FCSB. Опять же, центрифуга всех образцов на 10000 X г в течение пяти минут. Опять же, отказаться от супернатантов и повторно изготовить образцы в 100 микролитров FCSB.

После центрифугирования образцов в последний раз и отбрасывания супернатантов, повторное использование образцов в 150 микролитров FCSB. Перенесите каждый образец в трубку, содержащую 400 микролитров FCSB общим объемом 550 микролитров. Храните образцы при 4 градусах Цельсия, пока они не будут проанализированы цитометрией потока.

Вложение VLP измерялось с помощью цитометрии потока. Во-первых, плотность участков были использованы для выхода из клеточного мусора, а затем последующие точка участка gating для удаления бактериальных дублетов и клеточных комков. Репрезентативные гистограммы демонстрируют отсутствие сигнала PE в бактериальных только образцах и сдвиг интенсивности сигнала PE в образцах VLP:bacterium по сравнению с неоплитыми и изотипными контролями.

После одного часа инкубации с 10 микрограммами VLP, цитометрия потока обнаружила связывание частиц как с E.colacae, так и с L.gasseri. Для определения предела связывания количественной оценки для этого анализа, разбавления серии VLPs был создан до добавления к бактериям. Уменьшение количества ВЛП привело к соответствующему сокращению процентных бактерий, связанных VLP.

Зная вирус: соотношение бактерий и поддержание соотношения между экспериментами имеет важное значение в интерпретации результатов. Бактериальные и вирусные мутанты могут быть созданы специально для определения структур микробной поверхности, которые являются посредниками в этом взаимодействии. Этот метод позволяет исследователям отвечать на вопросы об обстоятельствах и условиях, которые влияют на норовирусно-бактериальные взаимодействия, в том числе о том, как изменения генотипа вируса, условия роста бактерий и изменения структуры бактериальной поверхности изменяют вирусную привязку.