Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов

Окрашивание тканей дрозофилы целиком, таких как образцы яичек, часто проблематично из-за ограниченного проникновения антител. Наш протокол фиксации с использованием NP40 и гептана позволяет обеспечить единообразное и воспроизводимое мечение. Сохраняя форму ткани и обеспечивая глубокое проникновение антител, эта процедура способствует воспроизводимому, количественно поддающемуся приобретению иммуноокрашивания в трех измерениях, как по отдельности, так и в исследованиях колокализации.

Для оценки диплоидных половых клеток, через 0-15 часов после экклюзии, обезболите мух путем кратковременного воздействия углекислого газа и перенесите мух на площадку для мух. Поместите подушечку под препарирующий микроскоп с 10-кратным увеличением и с помощью щипцов удалите головы от пяти до 10 самцов мух. Перенесите обезглавленные тела мух в 100 микролитров буфера Рингера на стеклянном предметном стекле с силиконовым покрытием на черной фоновой подложке и используйте 40-кратное увеличение и пару щипцов номер пять, чтобы захватить муху между грудной клеткой и животом.

Затем оттяните брюшную полость от грудной клетки и быстро изолируйте семенники и прилегающие ткани от тушки мухи. После того, как все яички будут собраны, очистите образцы от остатков ткани и с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров удалите излишки буфера вокруг рассеченных яичек. Затем капните каплю 4%-ного параформальдегида на яички и быстро перенесите ткани в пробирку, содержащую два миллилитра свежеприготовленного 4%-ного раствора параформальдегида с добавлением 20%-ного NP40 и гептана.

Для тщательной фиксации образцов семенников необходимо встряхнуть пробирку вертикально в течение 30 секунд перед инкубацией семенников на ротационном смесителе при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце инкубации перенесите пробирку на штатив для пробирок и дайте семенникам осесть на дне пробирки. Удалите весь гептан и фиксирующий раствор и быстро промойте яички три раза PBS.

После последнего промывки переложите яички в новую пробирку объемом 200 микролитров и используйте пипетку объемом 200 микролитров, оснащенную наконечником для пипетки объемом 10 микролитров, чтобы удалить излишки буфера. Затем добавьте 200 микролитров свежего PBS-В пробирку и поместите семенники на лед. Для мечения антителами образцов яичек замените PBS 200 микролитрами 0,3% PBS-T на 30-минутную инкубацию при комнатной температуре.

После пермеабилизации блокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 0,3% PBS-T плюс 5% нормальной козьей сыворотки в течение одного часа при комнатной температуре, прежде чем добавить 200 микролитров первичного антитела, разведенного в 0,3% PBS-T плюс 5% нормальной козьей сыворотки для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия или комнатной температуре с укачиванием. На следующее утро промойте образцы тремя 15-минутными промывками со свежим 0,3% PBS-T и покачиванием при комнатной температуре за промывку и дайте семенникам осесть на дно пробирки под действием силы тяжести. Добавьте 200 микролитров соответствующего вторичного антитела в пробирку для четырехчасовой инкубации с укачиванием при комнатной температуре, защищенной от света, перед промыванием образцов в свежем 0,3% PBS-T на промывку, как показано.

После промывки 0,3% PBS-T промойте образцы один раз в 0,2% PBS-T и один раз в 0,1% PBS-T в течение 30 минут на каждой промывке на коромысле, а затем заключительную 30-минутную промывку только в PBS. После промывки PBS пометьте образцы 180 микролитрами одного микрограмма на миллилитр раствора DAPI в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света, после чего последует три 5-минутные промывки в свежем PBS за промывку. После последнего мытья с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте круг на чистом предметном стекле, а с помощью наконечника пипетки, заполненного 0,1% PBS-T, перенесите яички на предметное стекло.

Отсадите избыток PBS и добавьте 100 микролитров Citifluor AF1. Аккуратно наденьте на ткань стеклянную защитную пленку, стараясь не задерживать пузырьки воздуха, и используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы приклеить защитное стекло к предметному стеклу, прежде чем наблюдать за предметными стеклами с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. После получения конфокальных изображений образцов импортируйте изображения в соответствующую программу для анализа изображений.

Затем используйте ручную сегментацию, чтобы определить ядро в каждой клетке и определить коэффициенты корреляции Пирсона внутри всего объема между двумя флуорофорами. Этот протокол позволяет получать конфокальные изображения достаточного качества для обработки для 3D-восстановления. Например, в этих четырех смежных последовательных срезах сперматоцита стадии S5 низкий уровень Mad1 наблюдается в ядерной оболочке, а высокий уровень накопления Mad1 может быть визуализирован в сочетании с окрашиванием DAPI в ядре

На этом 3D-восстановленном изображении можно наблюдать низкий уровень присутствия Mad1 на поверхности ядра и высокий уровень накопления Mad1 в ядре вместе с ДНК. В этих 3D-реставрациях можно наблюдать крупные сперматоциты S5, окрашенные нуклеопорином 62 и Mad1 или импортином-бета и DAPI. В обеих реконструкциях компоненты, связанные с ядерными порами, по-видимому, неравномерно распределены по ядерному кольцу в виде точек неправильного размера.

Сохраняя трехмерный объем клеток, этот протокол также способствует равномерному проникновению интересующих антител в глубину каждой клетки, что позволяет проводить количественный анализ, такой как колокализация. Поскольку протокол позволяет надежно измерять колокализацию из независимых яичек, его также можно использовать для сравнения окрашивания в различных генотипах мух. Используемое количество NP40 имеет решающее значение для достаточной пермеабилизации.

При тщательном соблюдении процедуры можно добиться воспроизводимого маркировки и сохранения ядерной структуры в 3D. Хотя окрашивание тканей дрозофилы может быть сложным, этот протокол может быть легко адаптирован для других образцов.