Многоклеточная альвеолярная модель человека, состоящая из эпителиальных клеток и первичных иммунных клеток для оценки опасности

Эти отдельные человеческие аудио модели использует соответствующие иммунные клетки в качестве мощного инструмента для прогнозирования острого иммунного ответа веществ, включая наноматериалы и знания наркотиков. Эти медицинские сочетает в себе человеческие эпителиальные клетки и человеческие первичные иммунные клетки для оценки этих конкретных реакций. Использование свежих и замороженных моноцитов обеспечивает гибкость для плана эксперимента.

Многочисленные исследования показали, что эта модель может обеспечить понимание межзвездной связи между чувством поведения и иммунным чувством. Поскольку эта демонстрация включает в себя все важные детали для шпильки модели личной чертой в клеточной культуре, визуальные инструкции для репликации экспериментов. Несколько этапов в протоколе мочевого пузыря являются сложными и требуют специальной обработки.

Поэтому они продемонстрированы со всеми необходимыми деталями, что они могут быть легко следуют. Для изоляции периферических моноцитов крови от человека Баффи пальто, разделить урожай Баффи пальто мешок содержимое, равномерно между 250 миллилитров конических труб. Аккуратно довнесите общий объем в каждой трубке 250 миллилитров с PBS и смешайте трубки с тремя нежными инверсиями.

Затем разделить Buffy пальто PBS решение поровну между четырьмя новыми 50 миллилитров труб, а затем добавить 10 микролитров CD 14 положительных магнитных бусин седьмой общей клетки в трубку и хорошо перемешать с помощью пипетки. После заполнения, отсоединить пипетку от pipetter и сразу же подключили верхнее отверстие пипетки с большим пальцем, то размещены заполнены пипетки в нижней части одной трубки и отключить пипетку открытия, чтобы плотность градиента среды медленно течь под баффи пальто PBS смеси, пока один миллилитр плотности градиента среды остается внутри пипетки. При добавлении градиентной среды плотности к каждой трубке таким же образом отделяют клетки по плотности градиентной центрифугации и используют серологическую пипетку для сбора белого двух-трехмиллиметрового толщиного периферического слоя моноядерных клеток крови между плазмой и плотностью градиентных средних слоев.

Лучший способ соединить слой, чтобы удалить плазму, а затем подавить наши логические пипетки для сбора клеток. Вытяните периферические моноядерные клетки крови из каждого набора из двух трубок в одну новую 50-миллилитровую трубку и промыть клетки два раза с общим объемом 50 миллилитров свежего PBS за стирку. Затем отбросьте супернатант и перерасходуйте пипетку в каждом из пяти миллилитров свежего PBS и объединить клеточные суспензии в одну трубку для подсчета.

После подсчета, центрифуга клетки снова и повторно пелет до 80 миллилитров магнитного буфера разделения на участие в седьмой клетки. Затем добавьте 10 микролитров CD 14 положительных магнитных шариков на участие в седьмом общей клетки в трубку и хорошо перемешать с помощью пипетки. После 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия смойте магнитную колонку тремя миллилитровами буфера магнитного разделения и добавьте клетки в столбец.

Вымойте столбец три раза с тремя миллилитровых объемов буфера на стирку и передать столбец в 15 миллилитров трубки, содержащей один миллилитр свежего магнитного буфера разделения. Затем используйте поршень и пять миллилитров буфера, чтобы промыть CD 14 положительных клеток в трубку. Индуцировать дифференциацию магнитного шарика изолированных CD 14 положительных клеток.

Во-первых, повторное течение клеток в один раз присутствовать на шесть клеток на миллилитр концентрации в среде культуры клеток. Или MDDC дифференциации, добавить 10 нанограммов на миллилитр и гранулы сайт макрофаг колонии стимулирующий фактор в трубку и добавить три миллилитров клеток в каждый колодец из шести хорошо пластины культуры клеток, или МДМ дифференциации добавить 10 нанограмм на миллилитр макрофагов колонии стимулирующий фактор клеток и пластины клеток, как только что продемонстрировали. Чтобы создать человека альвеолярной эпителиальной клеточной ткани тройной клеточной модели совместной культуры, первый передачи 1,5 миллилитров предварительно теплой среды клеточной культуры в соответствующее количество Уэллс из 12 хорошо пластины и место клеточной культуры вставить в каждый колодец.

Далее добавьте 500 микролитров эпителиальной клеточной суспензии при плотности в пять раз 10 до пятых клеток на миллилитр в апийскую сторону каждой вставки и накройте пластину в течение четырех дней инкубации в инкубаторе культуры клеток. Или MDDC посева заменяет супернатант из уэллс из шести пластин хорошо используется для дифференциации MDDC, с одним миллилитр свежей теплой среде культуры клеток и использовать клеточный скребок, чтобы отделить клетки соблюдения от каждой скважины. Вымойте каждый хорошо три раза с супернатом и в каждом хорошо и объединить все клеточные растворы в одну центрифугу трубки.

Собранные MDDC центрифугации и стерильные пинцеты, чтобы поместить вставки из 12 хорошо пластины вверх дном в стерильной чашке Петри. Очистите любые эпителиальные клетки с базальной стороны вставки и повторно почистьте MDDCs в среде свежей клеточной культуры, сделайте концентрацию в 4,2 раза 10 из этих клеток на миллилитр. Затем добавьте 150 микролитров клеток на каждую вставку, чтобы вся базальная поверхность вставки была одинаково покрыта жидкостью без пузырьков.

Для посева MDDM после сбора дифференцированных MDDMs, как попродемонстрировано для MDDCs, разбавить клетки в 2,5 раза 10 до четырех клеток на миллилитр свежей клеточной культуры средней концентрации и добавить 500 микролитров клеток вниз стены каждой эпителиальной клетки и MDDC, содержащих вставки клеточной культуры, а затем поместить крышку на пластину и поместить пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день аспирировать супернатант как из апических, так и из базальных областей каждой клеточной культуры вставки и Уэллса. Затем вы стерилизовать пинцет, чтобы поднять вставки из уэллса и добавить 600 микролитров свежей довоерной клеточной культуры среды для каждого колодца.

После шести дней дифференциации, MDMs появляются круглые формы в то время как MDDCs образуют кластеры, состоит из клеток с более удлиненной формы и наблюдаемых выступов. После трех дней роста на мембранных вставок, эпителиальные клетки образуют плотный Значительное увеличение высвобождения лактата дегидрогеназы наблюдается в среде клеточной культуры базального отсека при воздействии положительного контроля на разрыв мембраны, доказывая отзывчивость модели к цитотоксической субстанции. Нет увеличения высвобождения лактат дегидрогеназы, как измеряется на апкической стимуляции с TNF альфа или LPS.

Статистически значимое увеличение выбросов IL6 и IL8 наблюдается как в образцах альфа-обработанных LPS, так и в TNF по сравнению с контрольными необработанными клетками. Никаких различий в морфологии клеток не наблюдается между совместной культуры моделей с использованием MDDMs и MDDCs из свежих периферических моноцитов крови по сравнению с теми, которые используют талые клетки в LPS и TNF альфа подвергаются совместной культуры, нарушенный эпителиальный слой не наблюдалось. Можно использовать другие типы человеческих клеток, таких как дыхательные пути или бронхиолярные клетки, другие конечные точки также могут быть проанализированы.

Главным образом исследователя были воодушевляны этим методом используя подобное для того чтобы установить вверх но с по-разному типами клетки.