Модель ишемической болезни сердца и видео-сравнение кардиомиоцитов схватки с использованием hiPSC-производных кардиомиоцитов
5 мая 2020 г.
Мы представляем модель ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, вместе с методом количественной оценки повреждения тканей, вызванного ишемией. Эта модель может обеспечить полезную платформу для скрининга лекарств и дальнейших исследований ишемической болезни сердца.
Исследования сердечно-сосудистых заболеваний часто проводятся у мелких и млекопитающих, таких как грызуны. Тем не менее, физиология человеческого сердца значительно отличается от сердца грызунов. В нашем протоколе используются кардиомиоциты, дифференцированные от клеток iPS человека, для моделирования ишемической болезни сердца и количественной оценки повреждений и функциональных нарушений ишемических кардиомиоцитов.
Этот протокол может обеспечить удобный метод для персонализированного скрининга наркотиков с использованием клеток iPS, полученных от отдельных пациентов, надлежащее обращение с клетками iPS, например, при использовании свежей среды, и изменение среды медленно и пунктуально имеет решающее значение для обеспечения успешной дифференциации в функциональные кардиомиоциты. Демонстрация процедуры с Yun Liu, Yin Liang и Mengxue Wang будет Chen Wang, студентом PhD от лаборатории. Чтобы вызвать индуцированной человеком плюрипотентной дифференциации стволовых клеток в сердечные клетки, сначала пальто скважины 96 хорошо культуры пластины с 100 микролитров 1,675 микрограмм на миллилитр ламинина в PBS.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию, увидеть три раза 10 до четвертой стволовых клеток в 200 микролитров IPS обслуживания среды дополняется 10 микромолярной Y27632 в каждой хорошо, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. После 24 часов, заменить супер средства с 200 микролитров IPS среднего роста на колодец, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных двух-трех дней. Когда клетки достигают 70 до 80% слияния.
Замените среду в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды И вернуть пластину в инкубатор культуры клеток еще на 48 часов. В конце инкубации медленно заменяется супернатант в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды B и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Через два дня замените супернатанты 200 микролитров предварительно разогретой среды обслуживания кардиомиоцитов на колодец и назад вернули пластину в инкубатор клеточной культуры на срок до 30 дней.
Для оценки контрактности кардиомиоцитов установите велоциметрию изображения частиц j plugin и используйте фазовый контрастный микроскоп и цель вилки для записи видеоизображений клеток со примерно 20 кадрами в секунду в течение примерно 10 секунд. Затем сохраните видеофейс при анализе нашего API и создайте структуру папок, как указано. Для анализа дискретных двухмерных векторных полей клеточного смещения запустите VG и выберите плагины, макросы и отредактируйте для открытого векторного анализа.
ijm, а затем нажмите запустить анализ будет выполняться автоматически. Для ишемической обработки замените супернатант в каждой колодец 200 микролитров dmem без глюкозы и сыворотки, затем поместите пластину в Гипоксическую камеру, затем влить азотный газ в камеру, поддерживая внутреннюю концентрацию кислорода на уровне 2%и концентрацию углекислого газа на уровне 5% в течение 24 часов. Успешно дифференцированные клетки, демонстрирует спонтанное сокращение, наблюдаемое под микроскопом с 50% культурных скважин, как правило, проявляется спонтанное сокращение менее чем за 20 дней.
Сердечный маркер белка также может быть использован для подтверждения успешной дифференциации Клетки из ишемической группы, как правило, проявляют более низкую жизнеспособность в анализах МТТ, и более низкая контрактность, чем у нормоксической контрольной группы. Соотношение положительных клеток пропидия йодида также выше в ишемической группе, чем в контрольной группе, что свидетельствует о более высокой частоте повреждения клеток. Важно, чтобы вы точно найти области, представляющие интерес в захват пластины, чтобы позволить сравнение контрактности кардиомиоцитов.
Этот метод может быть использован для скрининга наркотиков, с использованием пациентов производных клеток iPS. Она также предоставляет уникальную платформу для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе ишемических заболеваний сердца
Обзор
В данной статье представлен протокол моделирования ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPS-CMs). Этот метод позволяет количественно оценить повреждение клеток и функциональные нарушения в условиях ишемии, предоставляя клинически значимую платформу для исследования сердечно-сосудистых заболеваний и персонализированного скрининга лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Сердечно-сосудистые исследования
- Биология стволовых клеток
- Клеточная физиология
Теоретические основы
- Ишемическая болезнь сердца является одной из основных причин смертности во всем мире.
- Модели на грызунах используются часто, однако они значительно отличаются от физиологии сердца человека.
- Кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляют собой более релевантную модель для изучения сердечно-сосудистых заболеваний человека.
- Существует потребность в платформах, которые способствуют как моделированию заболеваний, так и скринингу лекарственных препаратов в контексте человеческого организма.
Цель исследования
- Разработать протокол дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека в кардиомиоциты.
- Создать модель ишемической болезни сердца in vitro с использованием кардиомиоцитов из хиПСК (hiPS-CMs).
- Количественно оценить повреждение клеток и функциональные нарушения в условиях ишемии.
Используемые методы
- Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека в кардиомиоциты с использованием последовательной смены питательных сред и планшетов, покрытых ламинином.
- Индукция ишемии путем воздействия на кардиомиоциты из иПСК человека (hiPS-CMs) 2% кислорода и среды без глюкозы и сыворотки в течение 24 часов в гипоксической камере.
- Оценка жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста и окрашивания пропидия иодидом.
- Измерение сократимости посредством анализа поля векторов смещения с использованием фазово-контрастной микроскопии и программного обеспечения для цифровой трассировки частиц (PIV).
Основные результаты
- Ишемические условия привели к увеличению процента поврежденных клеток, о чем свидетельствует более интенсивное окрашивание пропидия иодидом.
- Жизнеспособность клеток в группе с ишемией снизилась по сравнению с контрольной группой.
- Сократительная способность hiPS-CMs была снижена в условиях ишемии.
- Примерно в 50% лунок культуры наблюдались спонтанные сокращения в течение 20 дней дифференцировки.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежную модель ишемической болезни сердца in vitro с использованием кардиомиоцитов человека.
- Эта система позволяет количественно оценить как клеточные повреждения, так и функциональные нарушения.
- Модель подходит для персонализированного скрининга лекарственных препаратов и дальнейшего изучения механизмов развития ишемической болезни сердца.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Модели кардиомиоцитов, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека, позволяют преодолеть трансляционный разрыв между исследованиями на грызунах и сердечными заболеваниями человека, обеспечивая более точное прогнозирование на ранних этапах разработки методов лечения ишемической болезни сердца. Количественный видеоанализ сократимости и тесты на жизнеспособность предоставляют практически значимые данные для валидации мишеней и снижения механистических рисков. Данная платформа поддерживает принятие решений по портфелю проектов с учетом рисков, а также стратегии персонализированного скрининга лекарственных препаратов в области сердечно-сосудистых исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет изучать механизмы ишемического повреждения в системе, релевантной для человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью количественных показателей сократимости и жизнеспособности.
- Способствует снижению механистических рисков путем моделирования клеточных ответов, имеющих значение для заболевания.
- Повышает прогностическую уверенность при ранней сортировке портфеля в рамках сердечно-сосудистых программ.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную платформу на основе кардиомиоцитов из hiPSC для воспроизводимой оценки соединений.
- Позволяет получать количественные показатели сократимости с помощью анализа поля векторов смещения.
- Обеспечивает возможность масштабируемого видеоскрининга функциональных нарушений в условиях ишемии.
- Поддерживает готовность анализа для последующего скрининга лекарственных средств и изучения механизмов действия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с биологией заболеваний человека для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет использовать клетки, полученные от пациентов, для персонализированного профилирования ответа на лекарственные препараты.
- Снижает зависимость от моделей на животных, повышая релевантность доклинических данных применительно к заболеваниям.
- Способствует поиску и валидации биомаркеров в клинически значимом контексте.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель ишемии кардиомиоцитов, полученных из hiPSC, связывает этапы раннего поиска, идентификации перспективных соединений и трансляционных исследований, обеспечивая определение специфических для человека функциональных показателей и показателей жизнеспособности.
- Фундаментальная биология: количественная оценка ишемического повреждения и сократительной дисфункции для проверки гипотез и анализа сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели сократимости и жизнеспособности для отбора перспективных соединений.
- Аналитика: интегрирует видеоанализ смещения и тесты на жизнеспособность для проведения надежного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: позволяет создавать специфичные для пациента модели и способствует согласованию биомаркеров с клиническими конечными точками.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую масштабируемую платформу для поиска сердечно-сосудистых препаратов и изучения механизмов их действия.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и уменьшает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Стандартизирует функциональные тесты и поддерживает масштабируемые, воспроизводимые рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: Служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения биологических рисков на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию активов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и их продвижение с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт культивирования hiPSC, их дифференцировки и валидации кардиальных маркеров.
- Необходим доступ к гипоксическим камерам, фазово-контрастному микроскопу и программному обеспечению для видеоанализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости анализа и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных линий iPSC, полученных от пациентов, или при разных подтипах заболеваний.
- Тщательный выбор области интереса (ROI) имеет решающее значение для точного сравнения сократимости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
