Высокопроизводительный метод измерения времени седации алкоголя индивидуальной дрозофилы меланогастер

Drosophila обеспечивает отличную модель для изучения генетических основ чувствительности алкоголя, потому что вы можете количественно чувствительность алкоголя именно под контролируемым генетическим фоном и условий окружающей среды. Современные методы измерения чувствительности алкоголя в Дрозофила тест групп мух. Мы представляем простой, недорогой, высокой пропускной метод для оценки чувствительности алкоголя в большом количестве одиночных мух.

Изменение чувствительности алкоголя в дрозофиле может быть переведено на аналогичные фенотипы у людей, потому что мухи разделяют около 75% своих генов с человеческими ортопедами. Разработанный ими анализ также может быть применен для измерения воздействия острой токсичности летучих веществ на других насекомых, включая другие виды мух или переносчиков болезней. Начните с создания картонного шаблона 24-хорошо пластины клеточной культуры.

След вокруг пластины, и вырезать назначенную область. Затем используйте картонный шаблон, чтобы создать кусок небольшой сетки экрана насекомых размером с тарелку. Поместите небольшую линию горячего клея по периметру 24-хорошо культуры пластины, и прикрепить сетку экрана на верхней части колодцев.

Затем используйте горячий клей пушки для обеспечения деревянные ремесла придерживаться трех сторон культуры пластины. Подготовь как можно больше тарелок в съемочной камере. Для создания съемочной камеры вырежьте отверстие размером с объектив видеокамеры с одной стороны полистироловой коробки и дополнительную щель размером с осветительные площадки на противоположной стороне.

Вставьте осветительные площадки в щель, и распоить камеру в отверстие объектива над подсветкой колодки. Поместите все испытательные материалы в контролируемую среду, предпочтительно поведенческую камеру с влажностью около 30%, температурой 25 градусов по Цельсию, равномерной воздушной потоком и уровнем шума менее 65 децибел. Используйте ранее сделанный картонный шаблон, чтобы нарезать два куска марли.

Затем пипетка один миллилитр 100% этанола через экран сетки в каждой хорошо. Высушите сетку и поместите два куска марли сверху. Вырезать небольшой кусочек тонкой, гибкой, пластиковой разделоченной доски с помощью картонного шаблона в качестве руководства для расширения области на один-два сантиметра на одной из коротких сторон.

После резки, убедитесь, что пластик по-прежнему помещается между тремя деревянными палочками ремесла на испытательном аппарате, но висит с одного конца. Подготовь аспиратор в соответствии с рукописными указаниями, и использовать его для передачи одной мухи на скважину в 24-хорошо пластины клеточной культуры, охватывающих любые скважины с ранее аспирированных мух с гибким пластиком. Завехать положение хорошо и любую соответствующую генотипную или фенотипную информацию каждой мухи.

Держите гибкий пластиковый флеш с верхней частью пластины культуры клеток, содержащих мух, и инвертировать пластину на верхней части модифицированной пластины культуры клеток с этанолом. Используйте палочки корабля для выравнивания перевернутой пластины культуры клеток, убедившись, что каждый хорошо с этанолом выравнивается с каждым хорошо содержащие муху. Убедитесь, что осветительные площадки освещены на полной яркости, и начать запись с видеокамеры.

Выставить мух на этанол, тщательно удаляя пластик между двумя пластинами, убедившись, чтобы не выбить марлю. Когда есть подозрение, что все мухи потеряли постуральный контроль, нажмите твердо в центре пластины. Если есть движение, продолжать записывать, нажав каждые одну-две минуты, пока движение не происходит.

Прекратите запись, как только не будет движения. Чтобы восстановить мух, удалить верхнюю пластину из испытательного аппарата, и аспирировать отдельных мух в выбранные контейнеры. Замените этанол в модифицированных пластинах культуры клеток по крайней мере один раз в час, чтобы поддерживать последовательное воздействие этанола на протяжении всего анализа, и повторить эксперимент для столько образцов, сколько хотелось бы.

Посмотрите видеозапись, чтобы определить время сеяния мухи, которое определяется как момент, когда муха теряет постуральный контроль и способность локомотива. Чтобы обеспечить точность, смотреть фильм в обратном направлении, и записывать время, что муха начинает двигаться. Этот метод может быть использован для генерации данных о большом количестве мух в течение 10 минут.

Две пластины 24-колодец были использованы для одновременного измерения времени эдации этанола для 48 отдельных мух двух линий DGRP с разной чувствительностью к алкоголю. Большие размеры выборки повышают точность и уменьшают погрешность до экологических изменений. RAL_555 были менее чувствительны, чем мухи RAL-177.

Мужчины и самки RAL_177 сексуально диморфического эффекта, в то время как самки линейных RAL_555 менее чувствительны к воздействию этанола, чем самцы. При попытке этого протокола, крайне важно выполнить стремление мух и инверсии пластины клеточной культуры с точностью для достижения желаемого результата. Поскольку способность оценивать одиночных мух позволяет избежать смешанных эффектов из-за групповых взаимодействий, этот анализ повышает полезность модели Дрозофилы для высокой пропускной способности исследований об остром воздействии воздействия алкоголя.