Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

При вспышках заболеваний, вызываемых арбовирусами, меры противодействия в значительной степени ограничиваются борьбой с комарами. Поэтому анализ векторной компетентности является критически важной стратегией профилактики, поскольку он позволяет определить, какие популяции и виды комаров могут служить переносчиками конкретного арбовируса и, следовательно, должны стать объектом воздействия. Таким образом, одним из наиболее важных инструментов для оценки роли комаров и других переносчиков в передаче инфекционных заболеваний является исследование векторной компетентности. Это эксперименты, в которых мы можем очень точно контролировать не только вид комара или, например, клеща, но и географические штаммы, а также конкретные штаммы различных вирусов или других инфекционных организмов, чтобы получить точные и хорошо контролируемые данные о риске передачи различных агентов разными видами в конкретных регионах мира. Работа с инфицированными комарами требует специализированных помещений, соответствующей подготовки, опыта и тщательного планирования для минимизации рисков для экспериментатора, а также риска побега инфицированного комара. Поэтому для новых сотрудников таких лабораторий весьма важно уделить время работе с неинфицированными комарами, питавшимися кровью, чтобы ознакомиться с техникой и рабочим процессом.

В день экспозиции включите источник питания в боксе для содержания членистоногих, чтобы предварительно нагреть устройства для кормления. Смешайте свежезабранную цитратную или гепаринизированную кровь человека с вирусным стоком в соотношении объемов один к одному, и накройте стандартный резервуар объемом 3 мл кожей наивного неинфицированного мыша. Поместите закрытый резервуар на белые бумажные полотенца и добавьте в резервуар около 2 мл инфекционной крови порциями по 1 мл.

Затем промокните бумажными полотенцами, чтобы убедиться в отсутствии утечек. За 24 часа до проведения анализа на инфекционность подготовьте 24-луночные планшеты для культивирования клеток с клетками Vero, промаркировав каждую лунку с указанием особи комара и образца. В день кормления комаров инфицированной кровью извлеките пропитанные водой ватные тампоны и с помощью прозрачной пластиковой защитной перчаточной камеры закрепите резервуары с искусственной кровью на выводах устройства для кормления.

Поместите картонную коробку с голодными комарами в перчаточный бокс под устройство для кормления. После завершения кормления извлеките резервуар и погрузите его в свежеприготовленный 10% раствор гипохлорита натрия. Внутри перчаточного бокса перенесите охлажденных анестезированных комаров в чашку Петри со льдом и отберите сытых особей от несытых.

Перелейте сытых комаров обратно в картонную коробку, быстро накрыв ее сеткой и крышкой. Обрежьте излишки сетки по краям коробки и закрепите крышку скотчем. Добавьте на сетку ватный тампон, пропитанный стерильным фильтрованным 10% раствором сахарозы, и поместите коробку во внешний большой пластиковый контейнер с влажной губкой для поддержания влажности.

Инкубируйте вторичный контейнер при 27 °C, обеспечивая комарам неограниченный доступ к сахарозе до завершения экспериментов. С помощью механического аспиратора извлеките из контейнера заданное количество инкубированных комаров, после чего закройте пробирку для сбора ватным тампоном. Работая в перчаточном боксе, перенесите холодных анестезированных комаров в чашку Петри со льдом.

Удалите все шесть ног каждого комара и поместите их в предварительно маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую стерильный стальной шарик и 500 µL среды для сбора материала комаров (MCM). Осторожно поместите комара на каплю минерального масла, следя за тем, чтобы масло не касалось головы или хоботка насекомого. Вставьте хоботок в наконечник микропипетки, заполненный 10 µL термоинактивированного FBS, и дайте комару выделять слюну в течение 30 минут.

Извлеките наконечник пипетки со слюной в микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 µL MCM, а тушку поместите в отдельную пробирку объемом 2 мм со стерилизованным стальным шариком и 500 µL MCM. Перенесите пробирки в устройство для гомогенизации тканей с помощью бисерной мельницы внутри бокса биологической безопасности и измельчите все образцы тел и конечностей при частоте 26 Гц в течение пяти минут для высвобождения вирусных частиц в супернатант. Очистите все образцы путем центрифугирования при 200 ×g в течение пяти минут для осаждения клеточного дебриса.

Непосредственно перед инокуляцией образцами удалите среду из предварительно подготовленных клеток Vero. Осторожно внесите по 100 µL осветленного супернатанта, полученного из туловища или ног, в каждую лунку, стараясь не задеть осадок из клеточного детрита комаров. Затем инкубируйте планшеты в течение одного часа.

После инкубации добавьте в каждую лунку по одному миллилитру верхнего слоя метилцеллюлозы и верните планшеты в инкубатор на срок от трех до семи дней. Извлеките планшеты с верхним слоем из инкубатора и перенесите их в бокс биологической безопасности. Удалите слой метилцеллюлозы в поддон с 10% раствором гипохлорита натрия, затем дважды промойте каждую лунку PBS, сливая промывочный раствор в поддон.

Удалите PBS, добавьте по одному миллилитру смеси метанола и ацетона в каждую лунку и оставьте клетки для фиксации на планшете на 30 минут. Затем слейте фиксатор и дайте планшетам высохнуть. Промойте каждую лунку трижды нестерильным PBS на орбитальном встряхивателе по 15 минут на каждую промывку, затем добавьте в каждую лунку один миллилитр блокирующего раствора и встряхивайте планшет еще 15 минут.

Добавьте по 100 microliters первичных антител к вирусу Зика или к флавивирусам в каждую лунку и инкубируйте планшет в режиме покачивания в течение ночи. На следующий день удалите первичные антитела и повторите промывку PBS. После последнего промывания добавьте 100 microliters вторичных антител и инкубируйте планшет при покачивании в течение одного часа.

Повторите промывки PBS, затем добавьте в каждую лунку по 100 µL реагента для проявления субстрата и перемешивайте планшет на качалке в течение 15 минут. После появления фокусов или бляшек остановите реакцию, промыв планшет проточной водой. Слейте воду и дайте планшетам высохнуть на воздухе, затем подсчитайте количество вирусных фокусов, чтобы определить число фокус-образующих единиц в данном образце.

Три популяции комаров были подвергнуты воздействию штамма вируса Зика, вызвавшего вспышку заболевания, при различных титрах в порции крови. В течение следующих двух недель отдельные группы комаров были обработаны для определения степени инфицирования, диссеминации и потенциальной скорости передачи. При низких титрах в порции крови комары из Сальвадора (Бразилия) были инфицированы через 4, 10 и 14 дней внешней инкубации, при этом в исследованных конечностях признаков диссеминированной инфекции обнаружено не было.

При самом высоком титре вирус обнаруживался в ногах комаров, но не в слюне. Комары из Доминиканской Республики оказались наиболее восприимчивыми к заражению и продемонстрировали самую высокую способность к передаче вируса при всех протестированных титрах в порциях крови. У комаров, получавших все три дозы, к седьмому дню наблюдалась диссеминация вируса, а к 14-му дню после заражения — способность к его передаче.

Комары из долины Рио-Гранде в Техасе, подвергнутые воздействию более низких титров кровяной порции, были инфицированы уже через четыре дня после заражения, в то время как диссеминированные инфекции были обнаружены через 14 дней. В группе, подвергнутой воздействию самого высокого титра, инфекция наблюдалась начиная со второго дня после заражения и достигала пиков на 4, 10 и 14 дни. Диссеминированные инфекции наблюдались на седьмой день, и только один комар был способен к передаче инфекции на 10-й день.

При выполнении данного протокола важно уделять приоритетное внимание безопасности, а не скорости работы. Поэтому всегда работайте с инфицированными или потенциально инфицированными комарами внутри перчаточного бокса или бокса биологической безопасности до тех пор, пока у них не будут удалены лапки или крылья. Базовый рабочий процесс оценки векторной компетенции может быть адаптирован как для получения инфицированных комаров для последующего анализа, например, исследований трансмиссии, так и для изучения взаимодействий между комарами, вирусом и микробиомом.

Оценка векторной компетенции на протяжении многих десятилетий служит важнейшим инструментом для понимания роли комаров в передаче вирусов во время эпидемий вирусных заболеваний. Этот метод развивался с годами, дополняясь новыми данными о взаимодействии между вирусами и комарами-переносчиками по мере их получения. В качестве двух примеров можно привести генетическую популяцию вируса: сложность популяции внутри комара оказывается очень важным фактором для его способности к передаче, и теперь мы можем учитывать это в исследованиях векторной компетенции, используя новые методы секвенирования вирусной популяции.

Теперь нам также известно, что популяция бактерий и других организмов, обитающих в желудочно-кишечном тракте комара, также может оказывать значительное влияние на их способность к передаче возбудителя, и сейчас мы можем оценивать эту популяцию с помощью новых методов секвенирования. Таким образом, определение векторной компетенции — это метод, который развивался и продолжает развиваться по мере того, как мы узнаем больше об этих сложных взаимодействиях.