Бенчтоп Подход к местоположению Конкретный барьер мозга крови Открытие с помощью целенаправленного ультразвука в крысиной модели

Целенаправленное УЗИ с микропузырьом может открыть геммоградный барьер фокусно и преходяще. Этот метод был использован для доставки широкого спектра агентов через гем blood brain barrier. В этой статье содержится подробный протокол для локализованной доставки в мозг грызунов с руководством или без МРТ.

Сфокусированный ультразвук в сочетании с циркулирующими микропузырьками может быть использован для создания временных отверстий размером в миллиметр в гематоэнцефалическом барьере. Это обеспечивает неинвазивную доставку системно циркулирующих агентов в целевые области мозга. Для начала заполните пробку катетера физиологическим раствором и согрейте хвост крысы лампой, стараясь не перегреть животное.

Вставьте катетер хвостовой вены 24 калибра, который будет использоваться для доставки микропузырьков, синего красителя Эванса, контраста гадобутрола для МРТ при использовании МРТ и интересующего вас экспериментального агента. Кровь заполнит оболочку при попадании в вену. Медленно извлеките внутреннюю иглу, одновременно проталкивая влагалище дальше в вену.

Вкрутите пробку катетера в конец порта катетера, как только порт заполнится кровью. Осторожно оберните лабораторную ленту вокруг катетера и хвоста, чтобы удержать его на месте, начиная с небольшого кусочка вверху и двигаясь в каудальном направлении. Оставьте самый конец пробки катетера открытым.

Вставьте анестезиологическую линию в разъем для анестезии на стереотаксической раме. Затем закрепите голову животного в раме, поместив рот на прикусочную планку, направив ушные планки в оба ушных канала и закрутив установочные винты. Переместите животное на кровать для МРТ.

Используя параметры, описанные в текстовой рукописи, соберите корональные и аксиальные Т2-взвешенные изображения, которые захватывают весь мозг, а также реперные точки МРТ для координатных измерений. На корональных изображениях найдите изображение, на котором реперная точка является самой большой, указывая на центр реперной точки. Запишите расстояние от вершины реберной кости до интересующей области мозга в миллиметрах, как в медиально-латеральном, так и в дорсально-вентральном направлении.

На осевых изображениях найдите изображение, на котором видна самая вершина реперной кости, и запишите координаты X и Y для центра реперной кости и координаты X и Y интересующей области мозга. Рассчитайте расстояние от центра реберной кости до целевой области мозга как в рострально-каудальном, так и в медиально-латеральном направлениях. После сбора координат соберите предварительно отсканированные изображения.

Удерживая животное в этой стереотаксической раме, быстро транспортируйте его с кровати для МРТ на установленный настольный FUS. Следите за тем, чтобы животное оставалось спящим под действием наркоза. Вставьте рамку в держатель рамы и плотно зафиксируйте ее на месте.

С помощью машинки для стрижки побрите голову животного, затем расчешите лишнюю шерсть и нанесите крем для удаления волос на кожу головы. Оставьте на три минуты и протрите водой и марлей. При использовании МРТ-контроля прикрепите указатель и переместите указатель к месту проведения реперной точки МРТ.

Затем расположите указатель в самом верху и центре реперной точки МРТ, которая является точкой, от которой были рассчитаны все расстояния на изображении МРТ. Удалите указатель и переместите позиционер в медиально-латеральные координаты и рострально-каудальные координаты. Лизните кнопку нулевого положения и поднимите позиционер вверх, нажав кнопку вверх 50, чтобы можно было разместить водную ванну и гель для ультразвука.

Нанесите ультразвуковой гель на кожу головы животного и поставьте водную баню над животным, прижав к гелю окошко полиимидной ленты, следя за тем, чтобы в геле не было пузырьков воздуха. Наполните водяную баню дегазированной водой. Если вы используете датчик высокой мощности, опустите позиционер так, чтобы магнит находился прямо над водой.

Прикрепите датчик к позиционеру, осторожно опустив датчик в воду под углом и подключив магниты. Опустите позиционер в дорсально-подфюзеляжную координату и включите радиочастотный усилитель мощности. Введите один миллилитр на килограмм 3%-ного синего красителя Эванса, вставив кончик иглы в пробку катетера и сделав инъекцию.

Все животное должно посинеть в течение нескольких секунд, что указывает на правильное расположение катетера в хвостовой вене. Дайте красителю циркулировать в течение пяти минут, затем активируйте микропузырьки, сильно встряхивая их с помощью шейкера для мыльных пузырей. Переверните этот шприц несколько раз, чтобы получить равномерное распределение микропузырьков, затем присоедините и заполните крылатый инфузионный набор.

Установите шприц на инфузионный насос и настройте инфузионный насос на подачу 0,2 миллилитра со скоростью шесть миллилитров в час, обеспечивая медленную инфузию микропузырьков в течение двухминутного воздействия FUS. Вставьте крылатую иглу в пробку катетера. Сначала запустите инфузионный насос, подождите три секунды, затем запустите лечение FUS, нажав кнопку включения и на генераторе функций.

Повторите это дважды для каждой области с пятью минутами между ними, чтобы микропузырьки очистились. Нажмите кнопку включения на функциональном генераторе еще раз, чтобы остановить лечение FUS, когда инфузионный насос остановится через две минуты. Подождите пять минут, пока микропузырьки исчезнут, затем начните инфузию и вторую обработку FUS.

Сразу после второй процедуры ФУЗ введите гадобутрол контраст и интересующее средство. Общий объем поставляемых средств не должен превышать пяти миллилитров на килограмм. Чтобы подтвердить открытие BBB, поместите животное обратно на кровать для МРТ в том же месте и подключите анестезиологическую капельницу.

Соберите постсканы МРТ с теми же параметрами визуализации, что и изображения до сканирования, чтобы подтвердить усиление МРТ с гадобутролом в области отверстия ГЭБ. Этот протокол был использован для индуцирования локализованного открытия гематоэнцефалического барьера с помощью как маломощного иммерсионного преобразователя, так и высокомощного сфокусированного ультразвукового преобразователя. Во-первых, маломощный иммерсионный преобразователь был направлен либо на переднее, либо на медиальное полушарие мозга.

Животных приносили в жертву с перфузией или без нее, а отверстие ГЭБ визуализировали с помощью автофлуоресценции синего красителя Эванса. В более поздних экспериментах датчик FUS был направлен либо на гиппокамп, либо на переднюю поясную кору. В дополнение к синему красителю Эванса, контрастное вещество для МРТ гадобутрол было использовано для проверки целевого открытия ГЭБ в VIVO.

После того, как животные были принесены в жертву, автофлуоресценция синего красителя Эванса подтвердила место вскрытия. Чтобы оценить, может ли этот метод быть использован для адресной доставки генов, AAV 9, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, и контраст гадобутрола были введены сразу после открытия гематоэнцефалического барьера в гиппокампе. Животное было сфотографировано для проверки отверстия с помощью контраста гадобутрола.

Затем доставка генов была подтверждена экспрессией GFP. Этот протокол предлагает настольный подход к открытию гематоэнцефалического барьера под контролем МРТ с помощью фокусного ультразвука, который может быть легко адаптирован другими лабораториями для обеспечения неинвазивной трансляционной альтернативы стереотаксической хирургии.