Реконструкция одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур с помощью конфокальной микроскопии

Этот метод предлагает уникальные исследования для доказательства идентичности или физиологических характеристик вашей клетки на уровне одной клетки без необходимости инвазивного мечения. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он облегчает пространственное разрешение на уровне одной ячейки для анализа, а также позволяет различать и фоновый процесс. Таким образом, этот метод потенциально может способствовать идентификации и фенотипическому анализу патогенных микробов.

Этот метод также может быть применен для изучения фенотипической гетерогенности или мониторинга физиологического статуса интересующей микробной популяции. Демонстрировать процедуру будет Кёсуке Такабэ, доцент из моей лаборатории. Установка для конфокальной отражательной микроскопии и многоканальной конфокальной микроспектроскопии.

Подключите конфокальный микроскоп с рассканированными спектральными каналами к фотоумножителю. Оснастите микроскоп объективом с высокой числовой апертурой, с достаточным увеличением. И оснастить микроскоп зеркалом с полуотражением для микроскопии с конфокальным отражением, которая полагается на клеточное рассеяние падающего света для визуализации морфологии клеток.

Для многоканальной конфокальной микроспектроскопии оснастить микроскоп дихроичными зеркалами и с помощью лазерного измерителя мощности регулировать интенсивность освещения для каждой длины волны возбуждения. Затем установите выходной сигнал под микроскопом на постоянной основе по длине волны возбуждения. Чтобы получить изображение бактерий через микроскоп, установите размер точечного отверстия равным 1,0 единице площади в программном обеспечении микроскопа и установите время пребывания в пикселях для каждой длины волны возбуждения.

Установите разрешение сканирования. Для мелких клеток, таких как бактерии, используйте область сканирования 1024 на 1024. Установите диапазон Z-сканирования таким образом, чтобы охватывать интересующую область.

Используя спектральное окно от восьми до 10 нанометров, настройте детектор D-Scan на захват видимого диапазона длин волн. Затем получите многоканальные конфокальные микроспектроскопические изображения в последовательности от самых длинных до самых коротких длин волн возбуждения для создания Z-стеков флуоресцентных изображений и изображений конфокальной отражательной микроскопии, а также сохраните изображения в 16-битном формате tiff. Чтобы выполнить сегментацию клеток и реконструкцию врожденных флуоресцентных сигнатур одной клетки, откройте соответствующую программу для анализа изображений и дважды щелкните мышью, чтобы открыть один из предоставленных сценариев.

На вкладке редактора нажмите кнопку Выполнить. Появится окно выбора папки. Выберите каталог, в котором были сохранены изображения Z-Stack, и нажмите «Открыть».

Автоматически появится диалоговое окно с запросом на ввод параметра сегментации. Установите порог бинаризации изображения равным 0-1, бинаризацию изображения равным 0,45, верхний порог для области ячейки равным 200, нижний порог для области ячейки равным 10 и количество детекторов равным 32. Появится диалоговое окно с запросом ввода количества длин волн возбуждения.

Введите количество длин волн, используемых для получения изображения, и нажмите OK. Появится диалоговое окно, в котором запрашиваются входные данные для длин волн возбуждения. Введите длины волн возбуждения в последовательности от самой короткой к самой длинной и нажмите OK.

Появится новое окно изображения, представляющее изображение микроскопии с конфокальным отражением. Выберите произвольную область фона, которая будет использоваться для вычитания фона, и нарисуйте прямоугольник в изображении микроскопии с конфокальным отражением. Дважды щелкните в выбранной области, чтобы подтвердить выбор и найти новую директорию с именем signature.

Чтобы выполнить методы уменьшения размерности, создайте пустой каталог и назовите его parent_directory. Сохраните флуоресцентные сигнатуры каждой из двух популяций клеток в двух отдельных каталогах и откройте интерфейс командной строки рабочей станции. Введите команду.

Когда отобразится выбранный целевой каталог, выберите parent_directory. Затем в папке parent_directory найдите PCA. png, который будет содержать результирующий график анализа принципиальных компонент.

Здесь показана типичная флуоресцентная сигнатура бактериальной клетки для одной клетки, представленная в виде традиционного графика спектра и тепловой карты. На этом рисунке можно наблюдать неточную двухмерную сегментацию клеток, наложенную на исходное изображение популяции почвенных бактерий, полученное методом конфокальной отражательной микроскопии. В результате получены врожденные флуоресцентные сигнатуры для популяции, представленные в виде тепловой карты.

Обратите внимание, что внутрипопуляционная вариабельность была относительно незначительной после успешной сегментации клеток. Здесь показан пример неточной сегментации клеток, наложенный на ту же популяцию P.putida, что было показано ранее. Влияние неточной сегментации клеток на врожденные флуоресцентные сигнатуры популяции легко видно из значительного числа выбросов, наблюдаемых на соответствующей тепловой карте.

Неточная сегментация ячеек приводит к более свободному кластеру после анализа принципных компонент по сравнению с кластером типов, полученным после точной сегментации клеток. Несмотря на незначительные вариации врожденной флуоресцентной сигнатуры, наблюдаемые в отдельных бактериальных штаммах, каждая популяция образует отдельный кластер на графике анализа принципиальных компонент. На этом рисунке можно наблюдать неточную 3D-сегментацию клеток, наложенную на исходное изображение конфокальной отражательной микроскопии популяции почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae YM4271.

Обратите внимание на отсутствие выбросов и, как следствие, врожденные флуоресцентные сигнатуры для популяции. Важно получить как можно более чистое изображение с помощью конфокальной микроскопии и не допускать насыщения интенсивности сигнала, так как шум может испортить точность последующего анализа. Вы можете обучать модели машинного обучения с помощью врожденного набора данных западных сигнатур для использования в задачах классификации или прогнозирования, предлагая анализ популяции без тегов и фенотипическое прогнозирование.