Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты

Таким образом, анализ TBARS лучше всего использовать для внутрилабораторной общей оценки окислительного стресса в биологических образцах, в которой относительные уровни TBARS напрямую сравниваются между образцами, которые хранились и обрабатывались вместе. Эти анализы имеют чрезвычайно низкую стоимость (около 3 единиц) для тестирования 96 образцов по сравнению с коммерчески доступными наборами, которые стоят около 400 образцов, и позволяют анализировать только одну партию образцов. Описанный здесь метод может быть дополнительно адаптирован для конкретных применений, включая исследования стабильности биообразцов, а также для тех, для которых добавление антиоксидантов или других типов консервантов образца перед анализом является целесообразным или обязательным.

Чтобы избежать сильно изменчивых результатов, приготовьте свежие реагенты, убедившись, что pH не превышает четырех для цветных реагентов, и удалите любые пузырьки на пластине для набухания nidese перед измерением абсорбции. Начните с приготовления 0,8%-ного водного раствора тиобарбитуровой кислоты. Приготовьте пятимолярный раствор гидроксида натрия, растворив четыре грамма гранул гидроксида натрия в 20 миллилитрах воды.

Храните раствор в пластиковом контейнере. Он должен быть свежим для каждой партии. Добавьте четыре грамма тиобарбитуровой кислоты в 450 миллилитров деионизированной воды и с помощью магнитной мешалки аккуратно растворите ее.

Медленно добавляйте примерно четыре миллилитра раствора гидроксида натрия с шагом 100 микролитров, проверяя pH по мере растворения частиц тиобарбитуровой кислоты. Продолжайте добавлять гидроксид натрия до тех пор, пока все частицы не растворятся. Проверьте, что pH раствора не выше четырех с помощью полоски pH, затем доведите итоговый объем до 500 миллилитров с помощью деионизированной воды и храните водный раствор тиобарбитуровой барбаровой кислоты при комнатной температуре.

Приготовьте MDA bis диметилацеталь стандартные кривые растворы в двухмиллилитровых полипропиленовых пробирках с защелкивающейся крышкой. Путем разведения 200 микромолярного стокового раствора в воде, как описано в рукописи текста. Сделайте образцы вихревыми.

Промаркируйте стеклянные пробирки для анализируемых образцов, затем добавьте в каждую пробирку по 100 микролитров подготовленного образца. Добавьте 200 микролитров 8,1% SDS в каждый образец и аккуратно вращайте стеклянную трубку круговыми движениями, чтобы перемешать. Добавьте в каждый образец 1,5 миллилитра буфера из 3,5 молярного ацетата натрия, затем добавьте 1,5 миллилитра водного 0,8%-ного раствора тиобарбитуровой кислоты.

Доведите итоговое в каждой пробирке до четырех миллилитров, добавив 700 микролитров деионизированной воды. Плотно закройте стеклянные трубки крышками и инкубируйте их в нагревательном блоке, установленном на 95 градусов Цельсия, в течение часа. Накройте пробирки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить образование конденсата, затем извлеките пробирки из блока и выдержите их на льду в течение 30 минут.

После инкубации образцы и стандарты центрифугируют при температуре 1500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите 150 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки в лунку в 96-луночной пластине, удаляя любые пузырьки воздуха с помощью наконечника пипетки. Измерьте абсорбционную способность образцов на 532 нанометрах, затем вычтите среднее значение абсорбента пустых образцов из всех других показаний абсорбентов.

Создайте стандартную кривую и используйте ее для расчета неизвестных концентраций образцов. Были построены стандартные кривые MDA bis диметилацетола для определения пределов обнаружения и чувствительности анализа и уровней окисления в трех различных биологических образцах. В общей сложности 9 анализов TBARS были проведены на трех образцах в разные дни.

Для определения пределов обнаружения измеряли поглощение холостых образцов в течение трех разных дней. Минимальная концентрация вещества TBARS, необходимая для получения обнаруживаемого нешумопоглощающего сигнала, составляет 1,1 микромоляра. А чувствительность анализа составляет около 0,0016 единиц абсорбентов на микромолярное увеличение концентрации.

Анализ TBARS может быть использован для выявления изменений в перекисном окислении липидов различных биологических матриц. Для демонстрации этого был использован хлорид меди, который индуцировал инкорпорированное окисление лизатов клеток HEPG2 сыворотки крови человека и липопротеинов низкой плотности в ней. Анализ TBARS был проведен на образцах ЛПНП, содержащих ЭДТА, и уровни TBARS не изменялись между двумя обработанными и необработанными образцами ЛПНП.

Однако после того, как ЭДТА была удалена с помощью спиновой фильтрации, ЛПНП подвергся окислению медью, опосредованному двумя медью. Чтобы проиллюстрировать динамический диапазон анализа TBARS в сыворотке крови человека, к образцам была добавлена концентрация двух миллимолярных ионов меди, что привело к увеличению TBARS в шесть-семь раз. При выполнении этого протокола не оставляйте образцы на льду дольше 10 минут, а после центрифугирования оставьте их при комнатной температуре.

Для партий или подмножеств биообразцов, которые изначально не были собраны, обработаны и сохранены вместе, следует статистически оценить данные на предмет пакетных эффектов, чтобы убедиться, что артефактное окисление не повлияло на результаты. Преднамеренное количественное invitro окисление липопротеинов низкой плотности позволяет понять, как окисление влияет на биологию его функционирования.