Высокое разрешение Картирование белково-ДНК взаимодействий в мышь стволовых клеток полученных нейронов с использованием хроматина иммунопреципиентации-экзонуклеазы (ChIP-Exo)

Основным преимуществом нашего метода ChIP-exo является улучшенное картографическое разрешение взаимодействий белковой ДНК в клетке по сравнению с обычным методом иммунопреципитации хроматина. Чтобы приготовить магнитные шарики белка G для ChIP, смешайте магнитные шарики до однородности. Затем добавьте 25 микролитров магнитных шариков в двухмиллилитровую пробирку с низким связыванием белка.

Добавьте в бусины один миллилитр блочного раствора. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования, затем поместите пробирку на магнитную решетку на одну минуту. Как только надосадочная жидкость станет прозрачной, удалите ее.

Далее добавьте в бусины один миллилитр блокирующего раствора. Поместите трубку на качающуюся платформу при температуре четыре градуса Цельсия и покачивайтесь в течение 10 минут, затем кратковременно вращайте трубку. Поместите трубку на магнитный штатив и удалите надосадочную жидкость.

Добавьте 500 микролитров блокирующего раствора в магнитные шарики. Кратковременно поверните антитело против островка-1, затем добавьте четыре микрограмма антитела в трубку, содержащую магнитные шарики. Поместите трубку, содержащую магнитные шарики и антитела Islet-1, на качающуюся платформу при температуре четыре градуса Цельсия и покачивайтесь на срок от шести до 24 часов.

Чтобы начать иммунопреципитацию хроматина, промойте покрытые антителами шарики в одном миллилитре блокирующего раствора. Поместите пробирку с шариками, покрытыми антителами, на качающуюся платформу при температуре четыре градуса Цельсия на пять минут. После краткого вращения поместите трубку на магнитную решетку и удалите надосадочную жидкость.

Суспендируйте покрытые антителами гранулы в 50 микролитрах блокирующего раствора. Добавьте один миллилитр лизатов ультразвука к гранулам, покрытым антителами, затем инкубируйте образец на качающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Дав образцу инкубироваться в течение ночи, соберите жидкость с крышки, кратковременно вращая пробирку, затем поместите пробирку на магнитную стойку.

А через одну минуту аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Далее выполните серию стирок следующим образом. Добавьте в образец один миллилитр буфера холодной стирки, содержащего CPI.

Перемешивайте образец на качающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Кратковременно поверните пробирку с образцом, затем поместите на магнитный штатив. Через одну минуту удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.

Для первой ферментативной реакции и репарации и хвостоудаления DA добавьте в образец 38 микролитров автоклавированной воды двойной дистилляции, затем добавьте смесь для реакции с концом подготовки и смесь ферментов для конечного приготовления. Смешайте содержимое пробирки с помощью пипетирования, затем инкубируйте образец при температуре 20 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем промойте шарики образца буфером для промывки с высоким содержанием солей, буфером для промывки из хлорида лития и 10 миллимолярным буфером из трис-хлористого водорода, как описано ранее.

Чтобы выполнить лигирование индексного адаптера, добавьте в образец 27 микролитров холодного 10 миллимолярного трис-хлористого буфера. Затем добавьте индексный адаптер, усилитель лигирования и мастер-смесь лигазы. Инкубируйте образец при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Снова промойте шарики образца буфером для промывки с высоким содержанием соли, буфером для промывки хлорида лития и 10 миллимолярным буфером из трис-хлорида. Затем добавьте в образец 47 микролитров холодного 10 миллимолярного трис-хлористого буфера. Чтобы восстановить зазубрину в ДНК, образовавшуюся в результате отсутствующей фосфодиэфирной связи, добавьте в образец 11,1 микролитра заполняющей смеси.

Инкубируйте образец при температуре 30 градусов Цельсия в течение 20 минут. После ряда промывок добавьте в пробу 50 микролитров холодной автоклавной двойной дистиллированной воды. Чтобы расщепить ДНК ChIP в направлении от пяти простых до трех простых, добавьте буфер лямбда-экзонуклеазы и лямбда-экзонуклеазу и перемешайте образец с помощью пипетирования.

Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После того, как пищеварение будет завершено, повторите три мытья в последний раз. Чтобы вымыть образец ChIP из гранул, повторно суспендируйте образец в 75 микролитрах элюирующего буфера ChIP и инкубаторе при температуре 65 градусов Цельсия на 15 минут при 130-кратном G. Добавьте в образец 2,5 микролитра 20 мг на миллилитр протеиназы К.

Кратковременно обработайте образец вихрем, затем инкубируйте в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия. Кратковременно покрутите образец и поместите на магнитную решетку. Через одну минуту переложите надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую трубку.

Очистите и разбавьте ДНК. После очистки элюированной ДНК перенесите 16 микролитров извлеченного образца ДНК в ПЦР-пробирку. Добавьте в образец 1,2 микролитра денатурирующей и грунтовочной смеси для отжига.

С помощью программы, описанной в таблице шестой рукописи, денатурируют и отжигают праймеры к матричной ДНК. Добавьте к образцу три микролитра смеси для расширения праймера и запустите программу ПЦР, описанную в таблице 7 рукописи. Добавьте в образец 4,1 микролитра хвостовой смеси DA и запустите образец с помощью программы ПЦР, приведенной в таблице 8 рукописи.

Затем добавьте в образец 21,5 микролитра универсальной смеси для перевязки адаптера и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Добавьте в образец 29 микролитров смеси LM-PCR, затем запустите образец с помощью программы из таблицы 10 рукописи. После 18 циклов LM-ПЦР образцы ChIP-exo из моторных нейронов мышей подвергали электрофорезу на 1,5%-ном агарозном геле.

Результаты для ChIP-exo Islet-1 показали амплифицированные библиотеки ДНК от 200 до 400 пар оснований, что указывает на то, что библиотеки ChIP-exo были успешно амплифицированы с помощью LM-ПЦР. Полоса вокруг 100 пар оснований представляет артефакты от адаптеров и ПЦР-праймеров. Контроль без антител демонстрирует, что неспецифическая фоновая ДНК была расщеплена при лечении лямбда-экзонуклеазой.

С помощью ChIP-exo и ChIP-seq были идентифицированы места, связанные с островком-1. Сигнал ChIP-exo был сильно сфокусирован на сайтах связывания Islet-1, обнаруживая множественные кластеризованные паттерны связывания транскрипционного фактора Islet-1. Сигнал ChIP-seq отображал более широкие сигналы, указывающие на то, что ChIP-exo имеет более высокое разрешение отображения, чем ChIP-seq для Islet-1.

Множественные факторы транскрипции часто связывают ДНК рядом друг с другом в виде комплекса белок-ДНК. ChIP-exo позволяет нам изучить, как множественные факторы транскрипции распознают и регулируют целевую ДНК.