Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Общей целью следующего эксперимента по генетически отслеживаемому дизайну Caenorhabditis elegans является идентификация тканеспецифичных взаимодействий шаперонов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе простые в использовании анализы, такие как подгонка ИИ Голан и поведенческие показания, чтобы выявить новые тканевые взаимодействия. Для синхронизации эмбрионов без стресса используйте червячную кирку, чтобы переместить около 100 яиц из несинхронизированной червячной пластины на вновь установленную пластину NGM и выращивайте животных в соответствии с соответствующим графиком экспериментов.

Когда животные достигнут первого дня яйцекладки, медленно добавьте один миллилитр буфера М9 в тарелку, удаленную от бактериальной лужайки, и поверните пластину так, чтобы буфер полностью покрывал пластину. Наклоните тарелку в одну сторону, чтобы удалить жидкость и вымыть животных из тарелки. Когда все черви будут смыты с тарелки, используйте стандартный пластиковый наконечник для пипетки, чтобы вырезать квадрат агара вокруг места, где сосредоточены яйца, и поместите кусочек агара на только что установленную пластину NGM.

Выращивают яйца в тех же условиях культивирования. По окончании инкубации тарелка должна быть покрыта синхронизированными яйцами. После того, как вы вымоете всех животных из тарелки, как показано выше, добавьте один миллилитр свежего буфера M9 и используйте скребок для клеток, чтобы выпустить яйца из тарелки.

Когда все яйца будут отделены, переложите весь объем буфера из планшета в коническую пробирку для центрифугирования. Центрифугируйте пробирку и выбросьте надосадочную жидкость. После удаления надосадочной жидкости добавьте в тарелку до одного миллилитра свежего буфера М9 и пипетку для ресуспендии яйцеклеток.

Вымойте яйца еще пять раз, как только что продемонстрировано. После последней промывки яичная гранула должна стать белой, и все, кроме последних 200 микролитров надосадочной жидкости, можно удалить. Чтобы культивировать синхронизированных нематод для эксперимента, поместите около 30 яиц рядом с бактериальной лужайкой, и каждую интерференционную РНК-пластину и около 30 яиц на пластину, сидящую с пустым вектором, содержащим бактерии.

Затем выращивают животных в соответствующих условиях культивирования согласно протоколу эксперимента. Чтобы оценить эмбриональную летальность синхронизированных животных, когда животные начинают откладывать яйца, переложите около 100 яиц в пустую тарелку и разложите яйца по рядам, чтобы упростить подсчет. Через 24–48 часов подсчитайте процент невылупившихся яиц.

Для справки сравните яйца экспериментальных животных с яйцеклетками животных, обработанных пустыми контрольными бактериями вектора. Чтобы провести анализ на паралич, выращивайте синхронизированных по возрасту животных на пустых контрольных бактериях до тех пор, пока животные не достигнут взрослого возраста, но до начала яйцекладки. С помощью тонкого маркера нарисуйте линию на обратной стороне обычной пластины с агаром NGM и поместите на отмеченную линию пять-десять животных.

Установите таймер на 10 минут и подсчитайте процент животных, оставшихся на линии, как парализованных червей. Для справки сравните эти данные с процентом мутантных животных, выращенных на пустых контрольных векторных бактериях. Для валидации нокдауна белка поместите от 250 до 300 синхронизированных яиц на 60-миллиметровую интерференционную РНК-пластину NGM, сидящую на соответствующих двухцепочечных РНК-экспрессирующих или содержащих пустой вектор бактерий, и культивируйте яйцеклетки в течение соответствующего экспериментального периода.

В конце инкубации пересадите в общей сложности 200 молодых взрослых животных в колпачок пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащей 200 микролитров PBST, поддерживаемых при температуре выращивания животных. Осторожно закройте крышку и центрифугируйте животных при 1000-кратном G в течение 1 минуты. В конце центрифугирования добавьте в пробирку 800 микролитров свежего PBST и снова центрифугируйте червей.

Аккуратно удалите верхние 900 микролитров надосадочной жидкости, и промойте нематод в свежем ПБСТ еще 3 раза, как только что продемонстрировано. После последней промывки удалите все, кроме последних 100 микролитров надосадочной жидкости, и добавьте животным 25 микролитров буфера для проб 5X. Нагрейте образцы в течение 10 минут при температуре 92 градуса Цельсия и 1000 оборотах в минуту, прежде чем загрузить 20 микролитров каждого образца на гель SDS.

Затем проведите вестерн-блоттинг с использованием соответствующих антител для определения относительной стабильности интересующего белка и используйте денситометрическое программное обеспечение для определения интенсивности банов. HSP6, сбитый во время развития, приводит к сильной остановке развития у диких животных. В то же время сбитый в мышцах интерференционный штамм РНК HSP6, экспрессирующий RDE1 дикого типа в мышечной ткани, не вызывает остановки развития.

В то время как HSP6 сбивает специфический для кишечника штамм РНК, экспрессирующий дикий тип RDE1 в клетках кишечника, что приводит к сильной остановке развития и фенотипу. Мутация в HSP6 MG585, вызывающая умеренную задержку роста, может, таким образом, быть использована для скрининга усугубляющих или смягчающих шапероновых взаимодействий путем скрещивания штамма, несущего этот мутировавший ген, в кишечноспецифический интерференционный РНК-штамм и скрининга библиотеки шапероновой интерференционной РНК. Организация миозина и мутантных животных UNC45, обработанных интерференционной РНК STI1, AHSA1 или DAF41, аналогична таковой у червей дикого типа на четвертой личиночной стадии.

Хотя мутанты демонстрируют нарушенные саркомеры после достижения взрослого возраста. В отличие от этого, как мутантные животные UNC45, обработанные пустым контролем переносчиков, так и животные дикого типа остаются незатронутыми. Генетические взаимодействия не являются показателем физического взаимодействия.

Таким образом, необходимо провести последующие эксперименты с использованием скрининга генетических взаимодействий для валидации и непосредственного изучения природы идентифицированных взаимодействий.