Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Эта процедура была создана для использования для разработки передовых 3D печеночным культур in vitro, которые могут обеспечить более физиологически релевантную оценку генотоксических опасностей, связанных с наноматериальным воздействием как на острые, так и долгосрочные, повторяющиеся режимы дозы.

Данная модель Hep G2 представляет собой подходящую альтернативную систему тестирования in vitro для более надежной оценки потенциальной индукции фиксированного повреждения ДНК после длительного воздействия наноматериала с целью минимизации потребности в тестировании на животных. Модель сфероида Hep G2 обладает способностью оставаться жизнеспособной и функциональной в течение 14-дневного периода, а также поддерживать подходящий уровень пролиферации. Это позволяет тестировать ряд биохимических и генотоксичных конечных точек, включая анализ микроядер.

Прежде чем пробовать этот протокол, я предлагаю вам сначала сделать несколько тренировочных пробежек. Будьте осторожны при посеве клеток или смене среды, так как это требует деликатного подхода. Начните с добавления 100 микролитров стерильного PBS комнатной температуры в лунки 96-луночного планшета для культивирования.

Переверните крышку пластины и аккуратно нанесите пипеткой по 20 микролитров клеточной суспензии в центр каждой лунки канавки крышки. Используйте многоканальную пипетку, добавляя от двух до четырех капель за раз, чтобы обеспечить точность размещения. Сейте только четыре стероида за раз и убедитесь, что все кончики пипеток выровнены, прежде чем начать.

Угол, под которым вы держите многоканальный, будет влиять на то, как формируются сфероиды. Убедитесь, что капли расположены по центру в пазах лунок на крышке, затем аккуратно переверните крышку сверху пластины так, чтобы капли свисали над лунками с PBS. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней перед переносом сфероида на агарозу.

После инкубации извлеките планшет из инкубатора и осторожно приподнимите крышку с пластины, выбросьте PBS, постучите по пластине, чтобы удалить остатки жидкости, и дайте планшетам высохнуть на воздухе в течение двух-трех минут. После растапливания агарозы аккуратно взболтайте ее, чтобы удалить любые пузырьки, и добавьте по 50 микролитров в основание каждой лунки. Оставьте тарелку при комнатной температуре на две минуты, затем добавьте по 100 микролитров предварительно подогретого DMEM поверх твердого агарозного слоя в каждую лунку.

Поместите крышку с этими сфероидальными каплями обратно на пластину так, чтобы сфероиды снова свисали, затем центрифугируйте пластину в течение трех минут при 200 перегрузках, чтобы перенести сфероиды в отдельные лунки пластины. Выдержите пластину еще 24 часа, чтобы дать сфероидам осесть. После диспергирования сконструированных наноматериалов, или ЭНМ, разбавьте их до конечной желаемой концентрации с помощью предварительно нагретого DMEM.

Отасуньте по 50 микролитров среды из каждой лунки с помощью сфероидов и замените ее 50 микролитрами среды с ЭНМ. Чтобы собрать сфероиды, используйте пипетку объемом 200 микролитров для аспирации 100 микролитров среды клеточной культуры с сфероидальной тканью из каждой лунки, стараясь избегать контакта с агарозой. Соберите сфероиды в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров

Центрифугируйте сфероидную суспензию при 230 умноженных на G в течение пяти минут, затем удалите надосадочную жидкость и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа. Промойте гранулы сфероидов в одном миллилитре стерильной комнатной температуры PBS, затем центрифугируйте их при 230-кратном G в течение трех минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте сфероиды в 500 микролитрах 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте их в течение шести-восьми минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После инкубации осторожно пипетируйте трипсингированные клетки Hep G2 вверх и вниз, чтобы полностью диссоциировать и ресуспендировать их перед нейтрализацией одним миллилитром DMEM. Центрифугируйте клеточную суспензию при 230-кратном G в течение пяти минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах PBS. Чтобы создать кюветную воронку, поместите подготовленное предметное стекло микроскопа в металлическую опору, поместите фильтрующую карту поверх предметного стекла, затем закрепите кюветную воронку сверху.

Расположите кюветные воронки в цитоцентрифуге воронкой вверх так, чтобы в каждую из них можно было непосредственно добавить 100 микролитров клеточной суспензии. Затем приступайте к закреплению слайдов в соответствии с указаниями рукописи. Приготовьте 20%-ный раствор для окрашивания Giemsa, разведенный в буфере фосфатазы.

Аккуратно пипетируйте раствор вверх и вниз, чтобы перемешать его, затем отфильтруйте его с помощью сложенной фильтровальной бумаги в воронке. С помощью пастеровской пипетки добавьте от трех до пяти капель отфильтрованного раствора Гимзы в цитодот на каждом предметном стекле и оставьте на восемь-десять минут при комнатной температуре. Промойте предметные стекла в двух последовательных промывках фосфатазным буфером.

Затем кратко промойте их под холодной водой, чтобы удалить лишнее пятно, и дайте им высохнуть на воздухе. Перед любой токсикологической оценкой in vitro важно убедиться, что сфероиды 3D HepG2 сформировались правильно. Через четыре дня после посева должны образоваться компактные сфероиды сферической формы с гладкой поверхностью и без визуальных проекций.

Здесь продемонстрированы сфероиды хорошего и плохого качества через четыре дня после посева. Как правило, от 90 до 95% сфероидов, образующихся на пластине, формируются правильно и становятся жизнеспособными для дальнейших экспериментов. Жизнеспособность и функциональность, подобная печеночной, оценивались в течение 14-дневного периода культивирования, чтобы определить долговечность модели сфероида печени и установить, может ли она поддерживать долгосрочную оценку опасности на основе ЭНМ или химических веществ.

Концентрация альбумина оставалась постоянной в течение периода культивирования, в то время как продукция мочевины на сфероид увеличивалась, прежде чем начать падать на 14-й день. Для оценки генотоксичности был использован анализ микроядер для определения наличия микроядер после острого и долгосрочного воздействия ЭНМ. Сфероиды подвергались воздействию двух ЭНМ, диоксида титана и серебра.

Аналогичная тенденция к генотоксичности наблюдалась после острого воздействия обоих ЭНМ, но повышенная реакция генотоксичности не была очевидна после длительного пятидневного воздействия. Следуя этому методу, можно собирать как надосадочную жидкость, так и сфероиды для множества биохимических конечных точек. К ним относятся жизнеспособность клеток, анализы функции печени, анализ SID 450, плохие маркеры воспаления и экспрессия генов.

Этот метод в настоящее время тестируется в ряде контрактных исследовательских лабораторий, которые хотят применить его для рутинных испытаний на геотоксичность как химических веществ, так и наноматериалов. Это может снизить зависимость от подходов к тестированию in vivo.