Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Этот протокол затрагивает два важных аспекта: характеристику незаменимой интегральной мембраны, аполипопротеинацилтрансферазы бактерий, и разработку анализа в формате HDS для скрининга ингибиторов фермента. Метод очень чувствителен и подходит для целей скрининга. Это может способствовать разработке потенциальных новых антибиотиков.

Это видео поможет осветить важнейшие этапы этого протокола, такие как смешивание, вортексинг, соникирование, при работе с неоднородными липидными и моющими суспензиями. Демонстрировать процедуру будут Карин Нозерет, Аурелия Пернин, обе являются стипендиатами моей группы. Начните с приготовления смеси реагентов для анализа аполипопротеинов и ацилтрансферазы или БЛТ.

Смешайте алкин POPE и FSL-1-биотин с реакционным буфером LNT в пробирках объемом 1,5 миллилитра при конечном объеме 18 микролитров. Приготовьте тройные смеси реагентов для всех испытываемых условий. Ультразвуком смеси реагентов обрабатывают в течение трех минут на ультразвуковой водяной бане, и выдерживают их при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем добавьте активную или неактивную БЛТ до конечной концентрации один нанограмм на микролитр и пипеткой вверх и вниз для перемешивания. Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в термомиксере с нагретой крышкой. Тем временем приготовьте стоковый раствор из расчета два миллиграмм на миллилитр стрептавидина.

И развести его до 10 микрограмм на миллилитр для создания рабочего раствора. Добавьте по 100 микролитров раствора в каждую лунку 96-луночной пластины. Затем высушите лунки на воздухе в течение ночи, инкубируя пластину при температуре 37 градусов Цельсия без крышки.

На следующий день приготовьте стоковые растворы из пяти миллимоляров Azido-FAM, 50 миллимоляров TCEP, двух миллимолярных TBTA и 50 миллимолярных пентагидратов сульфата меди. Выполните клик-химию, добавив 0,2 микролитра стокового Azido-FAM, 0,4 микролитра стокового TCEP и 0,2 микролитра стокового TBTA в 1,5-миллилитровые реакционные пробирки LNT. Ввергните раствор в течение пяти секунд.

Затем добавьте 0,4 микролитра бульонного медного купороса. Похлопайте вихрь еще пять секунд и инкубируйте реакцию в течение часа при комнатной температуре в темноте. Пока смесь клик-химии инкубируется, лунки покрытых стрептавидином пластин трижды промыть 200 микролитрами ПБСТ1.

Перелейте 18 микролитров смеси клик-химии в хорошо покрытый стрептавидином слой и добавьте 100 микролитров PBST1, чтобы связать продукт N-ацил-FSL-1-биотин FAM с пластиной. Добавьте флуоресцеин биотина в планшет в качестве положительного контроля связывания стрептавидина и считывания флуоресценции. Затем инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение одного часа в темноте, при этом встряхивая при 300 оборотах в минуту.

После инкубации с помощью многоканальной электронной пипетки вручную шесть раз промыть пластину 200 микролитрами PBST2. Промойте его три раза пипеткой. Промойте его три раза 200 микролитрами PBS и промойте еще три раза.

Добавьте 200 микролитров PBS в каждую лунку и определите флуоресценцию на 520 нанометрах в считывателе микропланшетов. Сохраните все результаты в электронной таблице, затем рассчитайте стандартное отклонение для каждой реакции, а также P-значения для отрицательных контрольных и положительных образцов с непарным Т-тестом. В описанном здесь анализе in vitro используются фосфолипиды, содержащие алкиновую жирную кислоту и FSL-1-биотин, в качестве субстратов для получения алкина FSL-1-биотина.

После химической реакции клика с Azido-FAM этот продукт становится флуоресцентно меченным и обнаруживаемым с помощью флуоресцентной спектрометрии. Условия реакции были оптимизированы для максимального считывания флуоресценции при 520 нанометрах. Отрицательный контроль включал реакции без фермента, с неактивным вариантом фермента или с тиолспецифическим ингибитором MTSES.

Биотинфлуоресцеин использовался в качестве внутреннего контроля для максимального флуоресцентного сигнала. Для разработки высокопроизводительного скринингового анализа реакции проводились непосредственно в 384 луночных планшетах. Этапы промывки были автоматизированы, а количество реагентов уменьшено.

Реакция была чувствительной и воспроизводимой со значительной разницей флуоресцентного сигнала между отрицательным контролем и активным ферментом. Для высокопроизводительного скрининга простой коэффициент Z определяет, достаточно ли велик ответ в анализе для целей скрининга. Средний простой коэффициент Z был больше 0,6 для анализа LNT, выполненного в формате 384 лунки, что свидетельствует о его выдающемся состоянии.

Пробирочный анализ, показанный в этом видео, был разработан в формате с несколькими планшетами, совместимым с HDS. Он может быть использован для изучения других ацилтрансфераз из различных организмов.