Отслеживание линий и клональный анализ при разработке коры головного мозга с использованием мозаичного анализа с двойными маркерами (MADM)
May 8th, 2020
Представлен протокол для отслеживания линий и функционального генетического анализа генов-кандидатов на уровне одной клетки с использованием мозаичного анализа с двойными маркерами (MADM). Клональный анализ MADM обеспечивает количественную основу для измерения пролиферативного поведения, клеточного выхода и родовых отношений отдельных прародителей и их клеток дочери.
Мозаичный анализ с помощью технологии Double Markers является мощным методом, который может предоставить высококоличеную информацию о поведении пролиферации и выводах погребов отдельных стволовых клеток. Уникальной особенностью этой техники, является то, что она позволяет отслеживания линии и функционального генетического анализа генов-кандидатов на уровне одной клетки.demontrating к процедуре будет, Кармен Streicher, ваш техник, Николь Amberge, пост-док, Gisselle Cheung, пост-док и Энди Хансен, аспирант из моей лаборатории. Для того чтобы навести события рекомбинации MADM в экспериментальных мышах, используйте шприц 1ml оборудованный с иглой 25 датчика для того чтобы поставить одиночную впрыску Tamoxifen Intraperitoneal в timed к супоросой запруде. От клонального анализа MADM до постнатальных точек времени. В эмбриональные дни с 18 до 19, поместите беременную мышь в положение на спине и дезинфицировать мех с 70%этанола. Сделайте небольшой разрез на коже в нижней части живота над маткой и сделать второй разрез через мышцы и брюшной мышечной стенки, чтобы выявить брюшной полости. Используйте ножницы, чтобы отделить матку от окружающих тканей и поместить неповрежденную матку в перчатку с теплой водой. Затем используйте тонкие ножницы и пальцы, чтобы тщательно открыть стенки матки, чтобы освободить эмбрионы. Очистите щенков мягко нажав сундуки время от времени, чтобы начать дыхание перед передачей пренатальных животных приемной матери. Для сбора нервной MADM Клон Ткань место анестезированные животные в положении на спине на перфузии хирургии лоток и дезинфицировать мех с 70% этанола. Используйте ножницы и типсы, чтобы сделать один разрез через кожу и один разрез через мышечный слой. Когда грудной полости видна, нюхать и поднимать диафрагму, чтобы выявить сердце и тщательно обрезать и приколоть грудную клетку к хирургической tray.insert иглы подключен к перистальтической трубки насоса заполнены PBS в левом нижнем желудочков сердца и использовать небольшие ножницы Iris, чтобы сделать разрез в задней части правого атриума. Perfuse сердечно-сосудистой системы с PBS следуют сразу же перфузии со свежеприготовленным ледяным холодом 4%paraformaldehyde в PBS. Когда перфузия завершена, удалить мозг через тщательное вскрытие и место собранного органа, по крайней мере в пять раз объем мозга свежих 4%paraformaldehyde ночь на 4
Обзор
В данном исследовании представлен протокол для линейного трассировки и функционального генетического анализа кандидатных генов на уровне одной клетки с использованием Мозаичного Анализа с Двойными Маркерами (MADM). Клоновый анализ MADM позволяет количественно измерять пролиферативное поведение и клеточный выход индивидуальных прогениторов и их потомков.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Линейная трассировка
- Генетический анализ
- Биология стволовых клеток
Фон
- Технология MADM имеет важное значение для понимания клеточной пролиферации.
- Метод позволяет проводить трассировку на уровне одной клетки.
- Применение включает оценку клеточных выходов и линейных отношений.
Используемые методы
- Мозаичный Анализ с Двойными Маркерами (MADM)
- Экспериментальная модель: Мыши
- Техники включают внутрибрюшные инъекции и перфузию тканей.
Основные результаты
- Обеспечило детальное исследование поведения прогениторов.
- Предоставило представление о линейных отношениях дочерних клеток.
- Продемонстрировало надежный метод для функционального генетического анализа.
Выводы
- Это исследование предоставляет комплексный протокол для использования MADM в генетическом анализе.
- Результаты вносят значительный вклад в область развиточной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
