Производство быстрорастущих бройлеров без зародышей из коммерческой линии для исследований микробиоты
18 июня 2020 г.
Здесь мы описываем метод получения безмикробных цыплят из яиц коммерческой бройлерной линии Ross PM3. Этот метод может быть адаптирован для генерации безмикробных животных из других видов домашней птицы.
До сих пор производство стерильной птицы ограничивалось породами животных для проведения исследований. Здесь мы показываем, что это можно сделать и с коммерческими животными. Данная методика позволяет проводить исследования влияния микробиоты с использованием генетического фона сельскохозяйственных птиц.
При использовании этого протокола важно контролировать разведение выбранного вида в стандартных условиях и обладать глубокими знаниями работы в изоляторах. Начните с установки 50-миллилитровых пробирок, пластиковых пипеток, облученного корма, автоклавной воды и стерильных герметичных пластиковых контейнеров в жесткий изолятор под положительным давлением. Заполните бактерицидную ловушку для переноса 2% четвертичным раствором аммония и трижды простерилизуйте изолятор парами формальдегида, перемещая материалы внутри изолятора между каждой стерилизацией, чтобы обеспечить дезинфекцию всех контактных поверхностей.
Не менее чем за два дня до введения яиц установите температуру изолятора на 37 градусов по Цельсию. В день внесения установите ареометр на отметку от 65 до 70% относительной влажности. После отбора чистых и безупречных яиц немедленно обеззаразите поверхность яйца, погрузив их в 1,5%-ный раствор надуксусной кислоты на пять минут, затем транспортируйте яйца в экспериментальное помещение с помощью ящика, обеззараженного парами формальдегида.
Храните яйца в течение 24 часов при температуре 14 градусов Цельсия, затем повторите стерилизацию 1,5% надуксусной кислотой и поместите яйца в инкубатор для инкубации на 19 дней. На 19-й день проверьте фертильность, жизнеспособность и развитие эмбриона с помощью светлой свечи для яиц в стерильных условиях. Выберите живые, эмбрионированные яйца и обеззараживайте их, опрыскивая их 1,5%-ным раствором надуксусной кислоты в течение 30 секунд или до тех пор, пока вся поверхность каждого яйца не будет покрыта.
Перенесите яйца в стерильные инкубационные изоляторы и промойте их стерильной деминерализованной водой перед помещением в инкубационное помещение. После вылупления животных содержат в стерильных изоляторах, кормят их коммерческим рационом, стерилизованным гамма-облучением, и поят автоклавной водопроводной водой. Через день после вылупления возьмите образец кала непосредственно из прямой кишки разных цыплят и сложите его в стерилизованную стеклянную пробирку.
Добавьте один миллилитр стула к девяти миллилитрам тиогликолатного бульона с резазурином и добавьте оставшийся образец к девяти миллилитрам Brain Heart Infusion или бульона BHI. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания в течение 18-48 часов. В 18 часов визуально осмотрите пробирки на предмет какой-либо модификации питательной среды.
Через 48 часов возьмите каплю из среды фекального бульона BHI, поместите ее на предметное стекло и понаблюдайте под микроскопом. При подозрении на присутствие бактерий возьмите образец из культуры BHI и поместите его на агаровую пластину BHI, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов в течение 18-48 часов. Если появляются колонии, идентифицируйте бактерии с помощью высокопроизводительного метода, такого как масс-спектрометрия MALDI-TOF.
Было проведено шесть циклов генерации стерильных цыплят с использованием яиц ROSS PM3, поступающих с двух разных французских ферм. В общей сложности было собрано 853 яйца, и после двух этапов обеззараживания и 19 дней инкубации 86,40% стали жизнеспособными. Из жизнеспособных яиц 490 прошли третью стадию обеззараживания и были введены в различные инкубационные изоляторы со средней скоростью вывода 79,80%Что соответствует коэффициенту вылупления 68,94% по сравнению с первоначальным количеством собранных яиц.
Результаты вылупления существенно варьируются от 41,67% до 88,16% жизнеспособных цыплят по сравнению с количеством собранных яиц. Этот эффект напрямую коррелировал с возрастом кур-несушек, когда яйца от старых кур были менее жизнеспособными. Шесть запусков были проведены с использованием четырех различных инкубационных изоляторов.
После бактериологического контроля было подтверждено, что животные из 14 из 16 изоляторов не содержат микробов, что соответствует уровню успеха 86,5%. Это требует соблюдения процедур дезинфекции и, прежде всего, контроля проникновения элементов через жидкостный воздушный шлюз. Эта процедура позволяет животным измерить влияние микробиоты на физиологию и здоровье птиц.
Его можно адаптировать и использовать для изучения микробиоты других сельскохозяйственных птиц или диких животных, если яйца доступны.
Обзор
В данной статье представлен метод получения безмикробных цыплят из коммерческих яиц бройлеров, в частности, линии Ross PM3. Эта методика позволяет проводить исследования микробиоты с использованием генетического фона сельскохозяйственных птиц.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Зоотехния
- Ветеринарная медицина
Теоретические сведения
- Предыдущие методы получения безмикробных птиц были ограничены исследовательскими породами.
- Данное исследование демонстрирует возможность использования коммерческой сельскохозяйственной птицы.
- Понимание влияния микробиоты на здоровье имеет решающее значение для управления птицеводством.
- Соблюдение стерильности в ходе процесса является необходимым условием успеха.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения безмикробных цыплят.
- Облегчить проведение исследований микробиоты коммерческого домашнего птиц.
- Оценить влияние микробиоты на физиологию и здоровье птиц.
Используемые методы
- Подготовка изоляторов с применением протоколов стерилизации.
- Дезинфекция яиц с использованием надокисляющей кислоты.
- Инкубация и мониторинг развития эмбрионов.
- Бактериологический контроль цыплят после вылупления.
Основные результаты
- Из 853 яиц 86,40% оказались жизнеспособными после деконтаминации.
- Средний показатель вылупляемости для жизнеспособных яиц составил 79,80%.
- Доля успешно полученных безмикробных цыплят в изоляторах составила 86,5%.
- Жизнеспособность коррелировала с возрастом несушек.
Выводы
- Данный метод обеспечивает основу для исследований микробиоты домашней птицы.
- Он может быть адаптирован для других видов сельскохозяйственных или диких птиц.
- Поддержание стерильности является критически важным условием для успешного получения безмикробных организмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет проводить исследования микробиоты коммерческих линий домашней птицы, восполняя важный пробел при переносе результатов исследований с исследовательских пород на генетику, имеющую промышленное значение. Создание безмикробных птиц из быстрорастущих бройлеров позволяет осуществлять прогностическое моделирование взаимодействий между хозяином и микробиотой у экономически значимых видов. Этот подход повышает достоверность трансляционного переноса результатов при разработке диетологических, иммунологических и физиологических мер воздействия в птицеводстве.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить гипотезы о влиянии микробиоты на развитие и физиологию иммунной системы с использованием коммерчески значимых генетических линий.
- Практическая ценность: предоставляет контролируемую систему с безмикробными организмами для изоляции микробных переменных при изучении реакций хозяина.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание стандартизированных биологических систем, свободных от микробиоты, для обеспечения стабильных результатов анализа при скрининге пробиотиков или кормовых добавок.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимых базовых измерений, критически важных для оценки влияния соединений на здоровье кишечника и иммунитет.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует снижению рисков при изучении механизмов, позволяя проводить контролируемую реконституцию микробиоты для оценки влияния конкретных штаммов на здоровье птиц.
- Практическая ценность: позволяет проводить лонгитюдные исследования от момента вылупления до стадий роста в определенных микробных условиях, что повышает прогностическую достоверность для доклинических кандидатов.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, предоставляя валидированную модель для тестирования вмешательств в микробиоту на ранних стадиях перед переходом к испытаниям на живых животных.
- Биологические исследования: Обеспечивают функциональную валидацию микробных мишеней и путей, влияющих на рост, иммунитет и использование питательных веществ.
- Скрининг: Позволяет использовать безмикробных цыплят в качестве воспроизводимой платформы для оценки кормовых добавок, вакцин или модуляторов микробиома.
- Аналитика: Обеспечивает количественный бактериологический мониторинг путем отбора проб фекалий и посева для подтверждения безмикробного статуса и отслеживания результатов микробного воздействия.
- Трансляционные исследования: Связывают результаты фундаментальных открытий с доклинической валидацией с использованием модели, имеющей коммерческую генетическую значимость.
- Корпоративное использование: Представляет собой масштабируемую и адаптируемую процедуру, применимую для различных видов домашней птицы и изоляторов в рамках долгосрочных программ НИОКР.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает уровень биологического шума в исследованиях микробиоты за счет устранения вмешивающихся переменных, возникающих при неконтролируемом воздействии микроорганизмов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стерильность изолятора с помощью валидированных протоколов дезинфекции, что способствует получению стабильных результатов экспериментов.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки кормов и продуктов для здоровья за счет получения ранних сигналов об эффективности и безопасности на физиологически релевантной модели.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов, модулирующих микробиоту, с учетом рисков на основе валидированного ответа хозяина в коммерческих генетических линиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт применения методов асептики и управления изолятором для поддержания стерильности на всех этапах работы с яйцами и выкармливания цыплят.
- Необходимо наличие оборудования для стерилизации, включая системы обработки парами формальдегида, пераксусную кислоту и гамма-облученные корма.
- Необходимы стандартизированные рабочие процедуры сбора, транспортировки и деконтаминации яиц для предотвращения нарушения стерильности изолятора.
- Требуется контроль параметров окружающей среды, в частности температуры (37°C) и влажности (65–70% RH), на этапах инкубации и вылупления.
- Требуется бактернологическая валидация с использованием тиогликолятного бульона и бульона BHI с последующим подтверждением отсутствия микроорганизмов с помощью микроскопии и посева.
