Введение точечных мутаций в плюрипотентные стволовые клетки человека с помощью бесшовного редактирования генома

Редактирование генов в плюрипотентных стволовых клетках человека является сложной задачей. Этот протокол обеспечивает детальную процедуру редактирования генома в этих клетках с использованием парного случая Cas-90 в сочетании с вектором-мишенью. Он надежен и прост в использовании.

Главное преимущество этого протокола в том, что он представляет собой бесшовное редактирование генома. Двухэтапный отбор помогает увеличить количество клеток-мишеней и сделал скрининг генотипирования более эффективным. Поддерживайте человеческие плюрипотентные стволовые клетки на рекомбинантных поверхностях, кодируемых ламинином 21 в среде mTeSR1.

Слияние клеток должно достигать от 70 до 85% через 72 часа после соотношения 1 к 3. В день трансфекции достаточно покрыть лунки 24-луночным планшетом 300 микролитрами раствора ламинина 521 и инкубировать планшет при температуре 37 градусов Цельсия не менее двух часов. После инкубации аккуратно удалите покрывающий раствор и сразу же добавьте в каждую лунку по 300 микролитров свежей среды mTeSR1, дополненной 10 микромолярным ингибитором ROCK.

Затем поставьте тарелку обратно в инкубатор. Достаньте из инкубатора исходные плюрипотентные стволовые клетки человека. Удалите отработанную среду и промойте клетки один раз одним миллилитром стерильного ДПБС.

Затем добавьте по одному миллилитру щадящего реагента для диссоциации клеток в каждую лунку и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести-восьми минут, чтобы диссоциировать клетки. Осторожно постучите по пластине, чтобы убедиться, что ячейки могут легко отсоединиться. Затем с помощью наконечника P1000 приподнимайте клетки путем пипетирования вверх и вниз.

Добавьте два миллилитра среды mTeSR1 с ингибитором ROCK, чтобы прекратить диссоциацию. Хорошо перемешайте суспензию и переложите ее в 50 миллилитровую трубку. Центрифугируйте клетки при 200 G в течение трех минут.

Затем удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах среды mTeSR1 с ингибитором ROCK. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра и трипана синего. Перенесите от 800 000 до 1 миллиона клеток в пробирку объемом 1,5 миллилитра для каждой реакции нуклеофекции и центрифугируйте их при 200 G в течение трех минут.

Затем осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Смешайте три микрограмма парной плазмиды экспрессии одиночной направляющей РНК Cas-9n и пять микрограммов векторной плазмиды в 100 микролитрах смешанного раствора нуклеофекции из набора для нуклеофекции стволовых клеток человека. Также приготовьте контрольную плазмидную смесь GFP.

Повторно суспендируйте клетки с помощью смеси ДНК и перенесите их в кювету для электропорации, следя за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. Электропорация клеток с помощью нуклеофекционного устройства с использованием оптимизированных условий для плюрипотентных стволовых клеток человека. Немедленно добавьте в электропорированные ячейки 500 микролитров свежей и теплой среды mTeSR1 с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK.

Затем переложите смесь в две лунки из заранее подготовленной 24-луночной пластины. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, содержащий 5% углекислого газа, чтобы позволить клеткам восстановиться. Замените поддерживающую среду через 12-16 часов, отменив ингибитор ROCK, если клетки вступают в контакт между клетками.

Через 24–48 часов проверьте эффективность нуклеофекции, исследуя экспрессию GFP в контрольных клетках. Начните отбор клеток, добавив в среду mTeSR1 один микрограмм на миллилитр пуромицина, через 48 часов после нуклеофекции. Через 72 часа дополните среду 0,5 мкг на миллилитр пуромицина.

Если слияние клеток ниже 30%, также дополните среду 10 микромолярным ингибитором ROCK. Через 4-6 суток после прохождения нуклеофекции пуромицин резистентен к 10-15 96 лункам в концентрации 0,8 клеток на лунку. Обязательно дополните среду ингибитором ROCK и пуромицином.

Поддерживайте в клетках температуру 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа в течение 10-12 дней, чтобы образовать колонии из одной клетки. Подсыпка медиума проходит через семь дней после посева. Отметьте лунки, содержащие одну колонию, и замените среду свежей средой mTeSR1, содержащей 0,5 мкг пуромицина на миллилитр, но не содержащей ингибитора ROCK.

Выращивайте клетки еще два дня при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем смените среду на лунки, содержащие недифференцированные колонии. Аккуратно соскребите колонии и перенесите клеточную суспензию из одной колонии в две новые лунки на отдельных 96-луночных планшетах.

Один для генотипирования, а другой для поддержания. Как только слияние генотипирующих клеток достигнет 50% или выше, сбросьте отработанную среду и промойте клетки один раз DPBS. Лизируйте клетки с помощью буфера для лизиса Брэдли и выделите геномную ДНК из каждой лунки.

После проведения ПЦР с тремя праймерными переходами и секвенирования продуктов, сохраните колонии с правильным генотипом и выбросьте остальные. Расширьте нужные колонии при непрерывном отборе пуромицинов и заморозьте их при первом прохождении. Этот протокол был использован для введения двух точечных мутаций в экзон8 гена четвертого альфа-фактора ядра гепатоцитов.

Для скрининга правильно нацеленных клеток был использован метод ПЦР на основе трех праймеров, а для подтверждения результатов ПЦР было выполнено секвенирование по Сэнгеру. После удаления селективной кассеты модифицированный участок снова секвенировали для подтверждения правильного введения желаемых точечных мутаций. Были отобраны колонии с правильным генотипом, и клетки были охарактеризованы перед дальнейшим анализом.

Отредактированные клетки обладают той же морфологией, что и родительские клетки, и экспрессируют репрезентативные маркеры плюрипотентных стволовых клеток человека, включая факторы транскрипции Nanog и Oct4, а также маркеры клеточной поверхности SSEA-4 и TRA-160. При попытке проведения этой процедуры важно не забывать проверять слияние клеток после выбора пуромицина в течение первых 24 часов. Важно дополнить медиану ингибитором ROCK.

Если слияние клеток ниже 30%, чтобы клетки продолжали существовать. После того, как линии плюрипотентных стволовых клеток, отредактированные в геноме, были созданы, они могут быть использованы для изучения функции генов или направленной дифференцировки. Этот метод открывает исследователям путь к изучению различных вопросов, таких как специфическая функция генов или целенаправленная коррекция генов при генетических заболеваниях.