Высокопроизводительный электрохемилюминесцентный 7-plex анализ одновременно скрининг на диабет 1 типа и множественные аутоиммунные заболевания
29 мая 2020 г.
Мы моделируем простой мультиплексированный анализ ECL, который объединяет 7 анализов аутоантител вместе. Анализ способен проводить скрининг на СД1 и множество других аутоиммунных заболеваний одновременно, включая целиакию, аутоиммунное заболевание щитовидной железы и аутоиммунный полигландулярный синдром 1.
Электрохемилюминесцентный анализ может одновременно проводить скрининг на диабет 1 типа и другие соответствующие аутоиммунные заболевания, включая аутоиммунную криоболезнь, целиакию и аутоиммунный полигландулярный синдром-1. Гораздо более сложный анализ ECR объединяет до 10 анализов на антитела в одной лунке, что приводит к высокой производительности, меньшему количеству библиотек и менее дорогому анализу, требующему менее широкого объема. Демонстрировать процедуру будет Сяофань Цзя, пост из моей лаборатории.
Чтобы приготовить смешанный раствор антигена, связанного с линкером, сначала выберите оптимальную концентрацию для каждого антигена, исходя из шахматного анализа, и разбавьте меченный биотином и рутением антиген до рациональной рабочей концентрации. Чтобы связать различные линкеры с каждым из уникально биотинилированных антигенов, для одного хорошо сыгранного анализа смешали 240 микролитров подходящего конъюгированного линкера СТРЕПТАВИДИНА с 4 микролитрами биотинилированных белков, представляющих интерес. Затем добавьте 156 микролитров 1%-ной БСА на пробирку и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут.
По окончании инкубации добавьте в каждую пробирку по 160 микролитров стоп-раствора и инкубируйте пробирки при комнатной температуре еще 30 минут. В конце инкубации удалите 400 микролитров связанного линкерного антигена из каждой пробирки и соберите все семь суспензий антигена в одну пробирку. Затем добавьте в смесь 1,2 миллилитра стоп-раствора и 4 микролитра меченого Ru сульфо-NHS антигена GAD65, TPO, tTg, ThG, проинсулина интерферон-альфа и IA-2.
Перед инкубацией образцов сыворотки с меченой смесью антигенов добавьте 15 микролитров сыворотки в лунку 96-луночного ПЦР-планшета и смешайте 18 микролитров 0,5 молярной кислой кислоты с каждой лункой сыворотки в течение 45-минутной инкубации при комнатной температуре. Во время инкубации добавьте 35 микролитров антигена и 13 микролитров одного молярного Трис-буфера в лунку нового 96-луночного ПЦР-планшета. В конце инкубации немедленно перелейте по 25 микролитров обработанной кислотой сыворотки в каждую лунку антигенной пластины.
Накройте тарелку потолочной пленкой для ПЦР и поместите тарелку на шейкер на низкой скорости при комнатной температуре на один час. В конце инкубации поместите тарелку при температуре 4 градуса Цельсия на 18-24 часа. Достаньте тарелку из холодильника, и дайте ей нагреться до комнатной температуры.
Затем добавьте в каждую лунку по 150 микролитров 3%-ного блокатора А-буфера. Когда все лунки будут обработаны, накройте пластину потолочной пленкой и поместите пластину в холодильник с температурой 4 градуса Цельсия на ночь. На следующее утро переверните планшет вверх дном и трижды промойте образцы 150 микролитрами PBS-T на лунку, на промывку.
Похлопывайте по пластине до тех пор, пока ни в одной из лунок не останется буфера. Добавьте в каждую лунку по 30 микролитров антигена сыворотки крови, инкубируйте. Когда все инкубации будут добавлены, накройте тарелку фольгой и поместите тарелку на шейкер на низкой скорости на один час при комнатной температуре.
В конце инкубации извлеките инкубаторы перелистыванием и трижды промойте лунки 150 микролитрами PBS-T на лунку, как показано на рисунке. После последней промывки добавьте 150 микролитров буфера для чтения в каждую лунку и считайте пластину на считывателе пластин, считая в секунду. В этом анализе большой когорты образцов от 1026 пациентов с впервые диагностированным сахарным диабетом 1 типа уровни аутоантител из 7 и более электролюминесцентного анализа сравнивались с уровнями каждого соответствующего установленного одиночного электролюминесцентного анализа и из каждого соответствующего стандартного радиосвязывающего анализа и ИФА.
Специфичность анализа была идентичной на 99-м процентиле для всех анализов на аутоантитела, за исключением аутоантител к щитовидной железе, для которых использовался 95-й процентиль. Небольшое количество дискордантных образцов для каждого из семи аутоантител было обнаружено на границе пороговых значений для каждого анализа. Здесь можно наблюдать соответствующие данные для 1022 здоровых контрольных групп для каждого анализа.
Самое важное, что нужно помнить, это найти различный линкер для каждого из уникально биотинилированных антигенов и смешать каждый антиген со свойствами для обеспечения конъюгированного линкера. Этот метод анализа позволит исследователям планировать скрининг на несколько аутоиммунных заболеваний одновременно в больших популяциях и позволит клиникам легко проводить скрининг нескольких соответствующих заболеваний с диабетом 1 типа.
Обзор
В данном исследовании представлен мультиплексный электрохемилюминесцентный (ЭХЛ) анализ, позволяющий проводить одновременный скрининг сахарного диабета 1-го типа и различных аутоиммунных заболеваний. Данный метод объединяет несколько тестов на аутоантитела в одной лунке, что повышает эффективность и снижает затраты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Аутоиммунитет
- Диагностика
- Электрохемилюминесцентный анализ
Теоретические основы
- Сахарный диабет 1-го типа (СД1) часто сопровождается другими аутоиммунными заболеваниями.
- Традиционные методы анализа могут потребовать проведения множества тестов, что увеличивает временные и финансовые затраты.
- Мультиплексные анализы позволяют оптимизировать процесс диагностики.
- Электрохемилюминесценция обеспечивает высокую чувствительность и специфичность.
Цель исследования
- Разработать мультиплексный анализ методом электрохемилюминесценции (ЭХЛ) для скрининга СД1 и связанных с ним аутоиммунных заболеваний.
- Сравнить эффективность мультиплексного анализа с установленными одиночными анализами.
- Обеспечить возможность проведения крупномасштабного скрининга в клинических условиях.
Используемые методы
- Приготовление растворов антигенов, конъюгированных со смешанными линкерами.
- Инкубация образцов сыворотки с мечеными антигенами.
- Использование 96-луночного формата планшетов для высокопроизводительного скрининга.
- Сравнение уровней аутоантител у пациентов с СД1 и в группе здорового контроля.
Основные результаты
- Мультиплексный анализ продемонстрировал специфичность, сопоставимую с результатами одиночных анализов.
- Выявлено небольшое количество несогласованных образцов вблизи пороговых значений отсечки.
- Получены данные по большой когорте пациентов с впервые диагностированным СД1.
- Обеспечен эффективный скрининг нескольких аутоиммунных заболеваний.
Выводы
- Мультиплексный анализ ЭХЛ является эффективным инструментом для одновременного скрининга.
- Данный метод может повысить эффективность диагностики в клинической практике.
- Рекомендуется проведение дальнейшей валидации на более крупных популяциях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Одновременное обнаружение нескольких аутоантител в одной лунке устраняет критическое узкое место в крупномасштабном скрининге аутоиммунных заболеваний, снижая сложность анализа и потребление ресурсов. Данный мультиплексный электрохемилюминесцентный подход повышает достоверность прогнозирования при ранней диагностике заболеваний, обеспечивая коррелированные показатели биомаркеров для диабета 1 типа и сопутствующих аутоиммунных состояний. Этот анализ способствует приоритизации портфеля препаратов и снижению механистических рисков при разработке иммунотерапии, позволяя эффективно проводить стратификацию пациентов на основе профилей множественных аутоантител.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем сопоставления кластеров аутоантител с эндотипами заболеваний в доклинических моделях.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной валидации антиген-специфических иммунных ответов в системах, релевантных для данного заболевания.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет идентификации подгрупп пациентов с конвергентными сигнатурами аутоантител.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка стандартизированных количественных панелей биомаркеров для последующих кампаний скрининга, требующих высокой воспроизводимости.
- Операционная ценность: Обеспечение готовности анализа за счет использования иммобилизованных комплексов антиген-линкер, которые гарантируют стабильное связывание в жидкой фазе во всех лунках.
- Масштабируемость: Облегчает повторное использование платформы для скрининга до 10 аутоантител на лунку, что увеличивает пропускную способность без необходимости изменения формата.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Соответствует системам, значимым для заболевания, путем обнаружения аутоантител, связанных с клиническим прогрессированием сахарного диабета 1 типа и коморбидных аутоиммунных расстройств.
- Развитие с учетом рисков: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем выявления пациентов с профилями аутоантител с высокой пенетрантностью, которые позволяют прогнозировать мультиорганный аутоиммунитет.
- Механистическое снижение рисков: Снижает неопределенность в интерпретации иммунных механизмов за счет одновременного измерения аутоантител к островкам, щитовидной железе, кишечнику и интерфероновому пути.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный анализ служит связующим звеном между этапами поиска и трансляции, обеспечивая раннее иммунное фенотипирование, которое с помощью мультиплексного профилирования аутоантител позволяет определить приоритетные мишени и провести доклиническую валидацию.
- Поиск новых биологических мишеней: способствует проверке гипотез путем установления связи между паттернами коэкспрессии аутоантител и патогенными путями в патогенезе аутоиммунных заболеваний.
- Скрининг: обеспечивает количественные воспроизводимые результаты, позволяющие сравнивать иммунные ответы при различных условиях лечения или генетических особенностях.
- Аналитика: предоставляет нормализованные данные о количестве прочтений в секунду, что позволяет проводить статистическое сравнение уровней аутоантител в когортах пациентов и контрольных группах.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет валидации панелей биомаркеров в образцах человека, отражающих связанную с заболеванием иммунную дисрегуляцию.
- Повторное использование в масштабе предприятия: создает универсальную платформу для иммуноанализа, которую можно адаптировать для других панелей аутоиммунных или воспалительных заболеваний помимо исходной конфигурации 7-plex.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени за счет снижения количества ложноотрицательных результатов благодаря одновременному измерению уровня аутоантител.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость за счет устранения вариабельности между лунками благодаря использованию иммобилизованного антигена.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет объединения семи диагностических тестов в один этап рабочего процесса.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию терапевтических кандидатов с учетом рисков на основе популяций пациентов, определенных по биомаркерам.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области разработки иммуноанализа и химии линкеров для иммобилизации антигена.
- Необходим планшетный ридер с возможностью электрохемилюминесцентного детектирования в 96-луночном формате.
- Требуется стандартизация протоколов блокировки и промывки между центрами при проведении многоцентровых исследований.
- Необходима адаптация концентраций антигенов при расширении списка мишеней для аутоантител за пределы первоначальных семи.
- Ограничение связано с необходимостью оптимизации пар линкер-антиген для предотвращения перекрестной реактивности в мультиплексном формате.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Mixed Linker-Coupled Antigen Solution
2:26
Serum Sample Incubation with Labeled Antigen
3:30
Multiplex Plate Preparation
3:57
Serum/Antigen Incubate Transfer
4:58
Results: Representative Autoantibody Level Evaluation
6:03
Conclusion
