Визуализация в реальном времени CCL5-индуцированной миграции периостальных скелетных стволовых клеток у мышей

Этот протокол описывает обнаружение CCL5-опосредованной миграции периостальных скелетных стволовых клеток в режиме реального времени с использованием прижизненной микроскопии живых животных.

Стандартизированный протокол может быть использован для оценки эндогенной миграции клеток и может быть применен к нескольким типам клеток, а также к скелетным фенотипам. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет отслеживать миграцию клеток in vivo для отдельных клеток, а не популяции клеток в ответ на повреждение и/или лечение цитокинами. Перед началом процедуры подтвердите отсутствие реакции на ущипывание пальца ноги у обезболиваемой мыши и нанесите мазь на глаза животного.

Затем сделайте поперечный, менее одного сантиметра, разрез от непосредственно медиального к правому уху к левому уху и сделайте второй разрез от первоначального разреза, примерно на два-три миллиметра мимо правого глаза в сторону носа. Используйте щипцы, чтобы отделить кожу от надкостницы, и с помощью ножниц аккуратно прорежьте соединительную ткань, чтобы отделить кожу от надкостницы кальварии. С помощью стерильного ватного тампона нанесите офтальмологическую мазь на верхнюю часть кожного лоскута и аккуратно сложите лоскут над левым глазом.

Пересечение сагиттального и коронального швов должно быть четко обнажено. Промойте открытую поверхность стерильным PBS, чтобы очистить область от крови и остаточных волос, и поместите кончик скоса на одну-две ширины иглы к носу от коронарного шва и на одну-две ширины иглы справа от сагиттального шва. Используя очень небольшое давление вниз, осторожно поверните шприц по часовой стрелке один раз и против часовой стрелки несколько раз.

Затем используйте иглу 27 калибра, чтобы расширить микротрещину примерно до 40 микрометров. Если костные отломки остались, промойте микрофрактуру с помощью PBS. Если костные фрагменты все еще остались, используйте иглу 29 калибра, чтобы аккуратно вычерпать фрагменты.

Для лечения CCL5 используйте 100 нанограмм на миллилитр стокового раствора CCL5 и матрицу базальной мембраны, чтобы получить рабочий раствор хемоаттрактанта с концентрацией 10 нанограмм на миллилитр. Чтобы обработать травму, загрузите пипетку объемом 220 микролитров пятью микролитрами раствора и нанесите два микролитра хемокина на шов. Затем дайте матрице застыть и аккуратно накройте кальварию кожным лоскутом, чтобы ткань не обезвоживалась во время часовой процедуры хемокиномом.

Для прижизненной визуализации миграции надкостничных стволовых клеток в режиме реального времени, прежде чем переместить мышь в микроскоп, слегка надавите на затылок мыши, чтобы проверить визуальную плоскость кальварии. Если плоскость не выровнена, осторожно поверните ограничитель мыши влево или вправо, чтобы отрегулировать положение. Затем покройте всю поверхность глазного яблока в кожном лоскуте стерильной 2%-ной метилцеллюлозой в воде и поместите мышь на моторизованный предметный столик для микроскопа по оси XYZ.

Используя эпифлуоресцентный свет, выровняйте мышь так, чтобы она была обращена к микроскопу и чтобы пересечение коронального и сагиттального швов было центральной точкой отсчета предметного столика. Затем наденьте стеклянную крышку на область визуализации и дважды проверьте выравнивание. Для покадровой съемки миграции внутрь и из шва выберите водно-иммерсионный объектив с малым увеличением для сканирования черепной поверхности.

Получите эталонное изображение пересечения сагиттального и коронального швов и, используя ГВГ и флуоресцентные сигналы от клеток, определите местоположение каждого места повреждения и запишите координаты XYZ, а также расстояния от сагиттального и коронального швов. Выберите место на корональном или сагиттальном швах для долгосрочной визуализации и получите подробное изображение этой области ZStack по референсу во время визуализации. Используйте настройки программного обеспечения для цейтраферной съемки для записи изображения каждые одну минуту в течение как минимум одного часа, сравнивая текущее поле зрения с начальным полем зрения во время между снимками.

Если поля зрения отличаются, используйте изображение ZStack, чтобы определить, в каком направлении необходимо настроить поле зрения. Недавно были получены мыши-репортеры Mx1 томата альфа-SMA GFP, у которых надкостничные скелетные стволовые клетки помечены Mx1-положительным альфа-SMA положительным двойным мечением. Миграция периостальных скелетных стволовых клеток практически отсутствует в течение одного часа визуализации, через 24 часа после наложения шва.

Лечение дефекта кальварии хемокином CCL5 через 24 часа после травмы вызывает направленную отчетливую миграцию от коронарного шва к месту повреждения. В этом репрезентативном анализе в течение одного часа после визуализации одна из положительных альфа-СМА Mx1 положительных периостальных скелетных стволовых клеток мигрировала примерно на 50 микрометров к месту повреждения. Наиболее важным аспектом этого протокола, о котором следует помнить, является ограничение лечения CCL5 местом повреждения, чтобы стимулировать клеточную миграцию.

После завершения этой процедуры местное лечение можно продолжать в течение одной недели. Микрокомпьютерная томография может быть использована для оценки заживления травм кальварии и отложения минералов.