Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток

Быстрая изоляция тканей ЦНС, включая мозговые оболочки, позволяет провести комплексный анализ фенотипа, функции и локализации иммунных клеток в гомеостатических и патогенных условиях. Эти два продемонстрированных метода позволяют быстро извлекать ткани ЦНС с мозговыми оболочками, что идеально подходит для последующего анализа с использованием методов одиночных клеток и гистологических методов. Несмотря на то, что репрезентативные результаты сосредоточены на анализе иммунных клеток, эти два метода могут быть использованы для анализа резидентных клеток ЦНС, включая микроглию, астроциты, перициты, эндотелиальные клетки, стромальные клетки и нейроны.

Начните с выделения образцов головного и спинного мозга у усыпленных мышей. После удаления головы сделайте разрез по средней линии на коже и переверните его над глазами, чтобы освободить череп. Разрежьте носовую кость, чтобы освободить нижнюю челюсть от черепа.

Затем удалите нижнюю челюсть, язык и глаза. Разрежьте вдоль боковых аспектов черепа, чтобы освободить ткань вдоль наружного слухового прохода и обрежьте его. Чтобы собрать образец спинного мозга, отделите грудную клетку от позвоночного столба, разрезав параллельно позвоночнику острыми ножницами.

Сделайте небольшой разрез в нижней поясничной области, чтобы изолировать позвоночный столб, затем обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки. При выполнении декальцинации ежедневно проверяйте кость, чтобы определить, является ли она мягкой и податливой. Извлеките ткань из раствора ЭДТА с помощью щипцов, поместите ее на чашку Петри и аккуратно проверьте мягкость кости иглой 25 калибра.

Если игла легко проникает в кость, процесс декальцинации завершен. Чтобы извлечь черепную крышку в мозге, сделайте разрез по средней линии на коже и переверните кожу над глазами. Поместите ножницы в большое затылочное отверстие и начните разрезать череп латерально вдоль коры головного мозга по направлению к обонятельной луковице, сохраняя разрезы над наружным слуховым проходом и нижней челюстью.

Выполните те же надрезы с противоположной стороны, причем надрезы сходятся у обонятельной луковицы, чтобы освободить черепную крышку от мозга. С помощью щипцов снимите тюбетейку и поместите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров холодной среды RPMI с добавлением 25 миллимолярного HEPES. Поместите изогнутые щипцы ниже основания мозга и поднимите их, чтобы освободить мозг от черепной крышки.

Извлеките позвоночный столб и ткань спинного мозга путем разреза параллельно позвоночнику, чтобы отделить грудную клетку от позвоночного столба. Затем сделайте небольшой надрез в нижней части поясницы, чтобы изолировать позвоночный столб. Обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки.

Затем поместите очень тонкие хирургические ножницы внутрь позвоночного столба и разрежьте вдоль бокового края столба. Полностью разрежьте противоположный боковой край, чтобы разделить позвоночный столб на переднюю и заднюю часть. С помощью щипцов медленно и осторожно отсоедините спинной мозг от позвоночного столба и поместите его в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров холодного RPMI с 25 миллимолярными HEPES.

Затем переведите передний и задний отделы позвоночного столба в другую трубку. Чтобы удалить мозговые оболочки из шлемки, извлеките тюбетейку из среды RPMI и с помощью острых щипцов сделайте надрез по внешнему краю. Снимите мозговые оболочки с края тюбетейки, соскоблив твердую мозговую оболочку и паутинные мозговые оболочки, и поместите мозговые оболочки на чашку Петри.

Чтобы удалить мозговые оболочки из позвоночного столба, извлеките позвоночник из среды и надрежьте по краям позвоночного столба острыми щипцами, чтобы освободить мозговые оболочки. С помощью изогнутых щипцов отклейте мозговые оболочки от края позвонков и поместите мозговые оболочки на чашку Петри. Поместите нейлоновое сетчатое ситечко в коническую трубку объемом 50 миллилитров

Чтобы создать клеточную суспензию, переместите мозговые оболочки в ситечко и добавьте три миллилитра HEPES, дополненного RPMI, затем с помощью поршня из пятимиллилитрового шприца измельчите ткань и среду через ситечко. Насыпьте ткань головного или спинного мозга со средой в 100-миллиметровую чашку Петри и с помощью щипцов переместите ткань на дно. Измельчите мозговую ткань стерильным бритвенным лезвием и соберите ткань на дне пластины.

Добавьте три миллилитра RPMI с добавлением 10% FCS в чашку Петри, затем используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров для ресуспендирования ткани в среде и перенесите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте в ткань коллагеназу 1 типа и DNазу 1 и инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Переворачивайте трубочки каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешать ткань с ферментами.

После инкубации добавьте ЭДТА в каждую пробирку до конечной концентрации 0,01 моляра и инкубируйте пробирки еще пять минут, чтобы инактивировать коллагеназу. Добавьте девять миллилитров RPMI с добавлением 10% FCS в каждую пробирку, затем центрифугируйте пробирки при 450 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Используйте пастеровскую пипетку с вакуумом для аспирации надосадочной жидкости, стараясь не касаться клеточной гранулы.

Добавьте три миллилитра 100% стокового изотонического градиента плотности в клеточную гранулу, затем добавьте дополнительный фильтрующий материал RPMI 10% FCS, чтобы довести окончательный объем до 10 миллилитров, и повторно суспендируйте клеточную гранулу. Переверните и хорошо перемешайте пробирку, затем вставьте на дно пробирки серологическую пипетку с одним миллилитром 70% исходного раствора изотонического градиента плотности. Медленно подкладывайте раствор, стараясь не образовывать пузыри.

Извлеките серологическую пипетку из пробирки, следя за тем, чтобы она не нарушила градиент. Центрифугируйте пробирку при 800 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, затем аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой миелиновых остатков, пока в пробирке не останется два-три миллилитра. Используйте пипетку объемом в один миллилитр для сбора клеточного слоя между градиентом плотности от 30% до 70% и переносите его в новую 15-миллилитровую пробирку.

Добавьте среду RPMI 10% FCS, чтобы довести окончательный объем до 15 миллилитров, затем центрифугируйте элементы при 450 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Этот протокол был использован для оценки В- и Т-клеток в мозговых оболочках, головном и спинном мозге во время прогрессирующего рассеянного склероза. Было проведено гейтирование для дифференциации инфильтрирующих иммунных клеток CD45 высокого периферического происхождения от CD45 низкой микроглии и CD45 негативных нейронов, астроцитов и олигодендроцитов.

Небольшое количество клеток высокого уровня CD45 присутствовало в спинном мозге и тканях головного мозга мышей, получавших фиктивное лечение. Такое же пороговое значение для высокой экспрессии CD45 было использовано в мозговых оболочках для идентификации клеток с высоким уровнем иммунитета CD45 и исключения неиммунных клеток. Во всех тканях ЦНС TMEV-IDD наблюдался повышенный процент клеток с высоким уровнем CD45 иммунного иммунитета по сравнению с мышами, получавшими фиктивную терапию.

Во время хронической ТМЭВ-ЙВН процент В-клеток среди клеток высокого иммунитета CD45 в головном и спинном мозге был выше по сравнению с менингеальным компартментом. Декальцинированные головные и спинные мозги были визуализированы для определения локализации В- и Т-клеток в компартменте ЦНС. Традиционное извлечение мозга из черепной чашечки привело к образованию неповрежденного слоя пиа, но остальные менингеальные слои были исключены.

Как в декальцинированном головном и спинном мозге, так и в спинном мозге все менингеальные слои были неповрежденными. Переключаемые изотип В-клетки и Т-клетки были локализованы с экспрессией IgG и CD3 соответственно. Костейнирование IgG с помощью ER-TR7 показало, что В-клетки присутствуют в паренхиме ЦНС и мозговых оболочках, в то время как клеточные агрегаты в ER-TR7-положительных мозговых оболочках содержат множественные IgG-положительные В-клетки и CD3-положительные Т-клетки.

Важнейшим этапом в этих протоколах является тщательная экстракция тканей ЦНС, необходимая для улучшения чистоты одиночных клеточных суспензий и получения гистологической ткани с высококачественной морфологией. Описанные методы позволяют проводить комплексный анализ клеток, занимающих компартмент ЦНС, что идеально подходит для изучения фенотипа, функции и локализации клеток при гомеостазе и во время патогенеза заболевания.