Name: Циркадная обучение Дрозофилы Меланогастер (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Узнайте метод синхронизации Drosophila melanogaster для исследования циркадных ритмов и хронобиологии. Этот подход позволяет изучать влияние биологических часов на физиологические процессы и поведение.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Особая благодарность Университету Миссури-Канзас-Сити и лаборатории Джеффри Л. Прайса.

1. Производство продуктов питания на лету
<ol><li>На каждые 1 л воды готовят мухомо пищу, состоящую из 4,69 г сушеной патоки, 19,70 г сухих активных дрожжей, 87,22 г кукурузной муки и 7,83 г агара.</li>
	<li>Объедините содержимое, перечисленное выше, в кастрюле и поверните тепло до 250 градусов по Фаренгейту. Хорошо перемешать, как ингредиенты добавляются.</li>
	<li>Держите крышку на кастрюлю, как муха пища нагревается, а также смешивания содержимого каждые 10 минут, пока не достигнет кипения. Разрешить прокатки кипения продолжать в течение 20 минут, прежде чем выключить огонь.</li>
	<li>Добавьте 83,60 мл воды и держите крышку кастрюли, как пища охлаждается.</li>
	<li>Смешайте и замитмите температуру пищи каждые 10 минут со стеклянным термометром. Не позволяйте слой пленки оседают на верхней части пищи.</li>
	<li>После того, как пища остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 10,44 мл тегосепта и 5,51 мл пропионовой кислоты на литр добавленной воды (см. шаг 1.1).</li>
	<li>Хорошо перемешайте и поверните нагреть до 60 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить слишком прохладное питание.</li>
	<li>Насос летать пищи по мере необходимости с помощью Droso-наполнителя.</li>
	<li>Для узких флаконов, насос 10 мл и для 6 унций квадратных нижних бутылок насоса 60 мл.</li>
</ol>2. Сбор мух определенного возраста
<ol><li>Монитор бутылки диких мух типа хранится при 25 градусов по Цельсию в течение 5-7 дней, пока большое количество куколки (около 200 куколок) прилагаются к стороне бутылки. Бутылки используются 6 унций Drosophila фондовых бутылок с квадратным дном.</li>
	<li>Очистим существующих взрослых от бутылки. Либо наконечник взрослых в новую бутылку или поместите их в 70% этанола. Используйте унылый конец #0, чтобы подтолкнуть оставшихся взрослых в пищу мухи. Будьте уверены, чтобы протереть краску щеткой вниз с 70% этанола до и после использования.</li>
	<li>Разрешить очищены бутылки сидеть в течение 3 дней в инкубаторе 25 градусов по Цельсию, чтобы для следующего поколения, чтобы исключить. Этим мухам будет от 0 до 3 дней.</li>
</ol>3. Разделение мух
<ol><li>Через 3 дня отделяем самцов от самок и собираем нужное количество для каждого пола для каждого из четырех пунктов времени. Мухи могут быть дифференцированы по полу путем изучения гениталий; мужчины имеют темные округлые гениталии в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Самки также намного крупнее самцов мух.<ol>
<li>Используйте CO2 анестезии площадку эффективно отделить мух и различать полов. Перемещение мух с краской кисти, чтобы избежать их убийства.</li>
		<li>Соберите 100 мужчин и 100 женщин для каждой точки времени, с 50 мужчин на флакон и 100 женщин на флакон. Мужчины, как правило, более агрессивным и их социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Самки до 100 особей не затрагиваются, находясь во флаконе.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Выполняем коллекции в следующих точках времени: NoT1, NoT7, ЗТ13 и ЗТ19(таблица 1). Обратите внимание, что коллекции, выполненные в темное время суток (ЗТ12-ЗТ24), светочувствительны, в то время как коллекции ЗТ0-ЗТ11 выполнены во время освещения и света комнаты. Обратите внимание, что два отдельных инкубатора используются с обратными 12-часовыми световыми узорами, позволяющими всем коллекциям происходить в течение дня, а не на ночь.</li>
	<li>Используйте лишние мухи, чтобы создать новые бутылки мух для будущего вовренности. Поместите 25 самок с 5-7 самцами в каждую новую бутылку и поместите в инкубатор при 25 градусов по Цельсию.</li>
</ol>4. Инкубация мух
<ol><li>Разрешить мухам оставаться в свет регулируется инкубаторов в течение 3-5 дней, чтобы циркадные увлечение происходит. Убедитесь, что инкубаторы светоемкие, потому что даже небольшое количество светового загрязнения будет беспокоить увлечение.</li>
</ol>5. Фиксация иммунофлюоресценции
<ol><li>После заезда подготовьте новые флаконы фиксационерного раствора для образцов, которые будут использоваться для иммунофлуоресценции. Перед удалением мух из инкубатора добавьте 4,8 мл 4% формальдегида, разбавленного в 1x PBS, и 0,1% Tween-20 к каждому новому узкому флакону на каждые 100 мух, которые должны быть зациклены. Каждый флакон будет в доме 100 мужчин или 100 женщин circadian заключенных мух. Поместите узкие флаконы во льду.</li>
</ol>6. Коллекция иммунофлуоресценции
<ol><li>При сборе мух из инкубатора для иммунофлуоресценции, удалить крышку бутылки и быстро инвертировать бутылку в воронку. Аккуратно нажмите мух в раствор через воронку, чтобы помочь направлять мух во флакон; объединить две трубки из 50 мужчин в общей сложности 100 мужчин в одном флаконе и использовать одну трубку из 100 женщин для другого флакона.</li>
	<li>Выполняем коллекции Т13 и Т19 в темноте; использовать красный свет для того, чтобы увидеть, как дрозофила гораздо менее чувствительны к этим длинам волн света и, следовательно, менее склонны к световомузагрязнению 13. Криптохромный белок, в частности, особенно чувствителен к синему свету, которого следуетизбегать 14.<ol>
<li>Чтобы уменьшить воздействие света, убедитесь, что комната сбора свет плотно с любыми источниками света заблокированы или покрыты. Оберните эти флаконы в фольгу так, чтобы мухи ЗТ13 и ЗТ19 не подвергались воздействию света при размещении на гайке смесителя на следующем этапе. Мухи ЗТ1 и ЗТ7 не светочувствительны и могут быть помещены на смеситель без покрытия фольгой.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Питательный смеситель и хранение
<ol><li>После того, как мухи были собраны, лента верхней части флаконов, содержащих фиксатор, чтобы избежать разлива и поместить их на ореховый смеситель при 165 об /мин при 4 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Мухи больше не светочувствительны после этого шага фиксации, так что фольга может быть удалена, чтобы проверить решение движется и мухи погружаются в фиксатор.</li>
	<li>После удаления мухи, содержащей флаконы из орехового смесителя удалить формальдегид и мыть три раза с 3000 йл 1x PBS, инвертирование флакона с каждой стирки.</li>
	<li>Храните флаконы с образцами иммунофторесценции при 4 градусах Цельсия в ожидании будущего иммунофлюоресценции15.</li>
</ol>8. Сбор для извлечения белка
<ol><li>Подготовка четырех трубок объемом 50 мл и двойки, содержащей жидкий азот, для сохранения образцов для извлечения белка</li>
	<li>Для сбора мух для извлечения белка или нуклеиновой кислоты, передача мух из бутылок в трубку таким же образом, как в шаге 6.1 и быстро крышка трубки, чтобы предотвратить высвобождение мух и поместить трубку в жидкий азот, чтобы оснастки заморозить.</li>
</ol>9. Хранение для извлечения белка
<ol><li>Храните замороженные образцы для извлечения белка при -80 градусов по Цельсию. Они могут быть обработаны в соответствии с протоколом извлечения белка подходит для анализа вниз по течению, в том числеиммуноблоттинг 16.</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

Ни один.

Исследователи используют этот протокол увлечение с успехом и последовательности. Эта процедура позволяет зафиксировать большой пул выборки, который может храниться для будущего анализа. Кроме того, эта стратегия сохраняет неврологические модели, вызванные увлечением для будущего обследования.
Фиксация для хранения является одним из основных компонентов процесса увлечение, как это помогает стабилизировать ткани мозга, и это позволяет больше времени для анализа каждого мозга из пула данных, таким образом, минимизируя отходы из мозга, которые теряют жизнеспособность из-завозраста 21. Основная цель состоит в том, чтобы циркадные увлечение как можно больше мух, как это возможно, так что существует непрерывный инвентаризации доступны для головы вскрытия и в конечном итоге иммунофторесценции или извлечения белка для наблюдения за выводами и определить, если результаты имеют высокую уверенность. Для обеспечения того, чтобы циркадное увлечение сохранясь путем фиксации, является неотъемлемой частью того, что любой источник светового загрязнения устраняется. Процесс фиксации позволяет дрозофилы храниться при сохранении его неврологических "timestamp", так что они могут быть вскрыты позже и проанализированы без каких-либо заметных различий для мух, которые вскрыты и подверглись иммунофлюоресценции сразу после влечения. Для целей фиксации до иммунофлуоресценции, лаборатория определила с консистенцией, что мухи являются жизнеспособными по крайней мере до 1 месяца. Фиксации для западной экстракции белка пятно сделать мозг жизнеспособным на неопределенный срок при хранимом при -80 градусов по Цельсию.
Другим важным шагом протокола является сексинг мух. Важно, что этот шаг делается точно, как с обоих полов в том же флаконе до фиксации может привести к спариванию, что даст новые мухи, которые имеют более молодого возраста и коррумпированных анализ белка, если мужчины случайно рассмотрены вместо женщин или наоборот. Кроме того, при половом акте важно удалить образцы личинок, которые иногда прикрепляются к самкам. Это предотвращает развитие нового потомства внутри женского флакона, который потенциально может повредить результаты.
Следующим шагом для протокола обучения могут быть элементы, связанные с анализом данных. Основное внимание в протоколе уделяется локализации белка, но если есть другие переменные, которые влияют на циркадное увлечение, они должны быть изучены с помощью новых путей, часто требующих извлечения белка или нуклеиновой кислоты. Кроме того, Есть другие белки мозга, которые все еще могут быть проанализированы с помощью этого протокола. Эксперименты, связанные с протоколом, анализировали определенные белки, но список генов и белков, которые играют роль в циркадной биологии, не исчерпан. Протокол эффективен в достижении цели установления циркадного ритма, однако, приложения являются широкими.

Почти все организмы на Земле, от крупнейших до одноклеточных, имеют внутренние биологические часы с циклом около одного дня. Это известно как циркадный ритм (придуманный в 1953 году Францем Халбергом из латинских терминов около й о/приблизительно и "умирает"и день) 1. Хотя компоненты основных часов известны и их рудиментарные механизмы функции концептуализированы, есть еще много, чтобы понять о том, как биологические ритмы поддерживаются по всему телу. Важно отметить, что неправильное регулирование биологических ритмов связано с плохими результатами для здоровья, включая плохое формирование памяти, расстройства сна, сезонное расстройство влияет, депрессия, биполярное расстройство, диабет, ожирение, нейродегенерация, и рак2,3,4,5.
Дрозофила является устоявшейся моделью для исследования циркадной биологии. Генетически и биохимически уместным, большое количество легко перенапряжены (как будет показано). В самом деле, все семь публикаций цитируется в качестве ключевых публикаций поддержки в присуждении Нобелевской премии за открытие циркадных ритмов использовали эти сильные стороны модели Drosophila6,7,8,9,10,11,12.
Кроме того, мы показываем эффективные стратегии сбора поглощенных мух для целей иммунофлуоресценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка. Используя эти стратегии, можно обрабатывать и хранить большие объемы образцов для анализа в будущем. Эти методы очень выгодны тем, что они воспроизводятся и могут дать сотни поглощенных мух, которые могут быть частью большого пула данных.

<table><tbody><tr><td>Пипетка 100-1000 мкл</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100 мкл пипетка</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16% раствор параформальдегида</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Агар</td><td>Фишер Научный</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>Набор для подключения фильтра для анестезии Мир</td><td> Precision Instruments</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>Кукурузная мука</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>Сухая патока</td> для <td>пищевых продуктов Direct</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>Дрозо-наполнитель Пищевой насос</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>бутылок Drosophila, квадратное дно 6 унций с флаконами</td><td>geneseesci.com</td><td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>Дрозофила, узкая K-смола супер объемные</td><td>geneseesci.com</td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>Сухие активные дрожжи</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>Этанол</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ Базовая система анестезии</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>Центрифуга Falcon Tubes</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon круглые донные трубки</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>Маркер Sharp</td><td>Sharpie</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Смеситель для нутации Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Флагс-узкие пластиковые флаконы</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянный термометр</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>Шланг для жидкого азота</td><td>Thermo Scientific</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>Резервуар для жидкого азота - Dewar</td><td>Cooper Surgical Inc</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>Сосуд для переноса жидкого азота</td><td>Электронная микроскопия Науки</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>Кисти (Красный Соболь) Размер #0</td><td>Электромикроскопия Науки</td><td>66100-00</td><td>Используется для разделения мух половым путем, не причиняя травм.</td></tr><tr><td>Пластиковая воронка</td><td>Plews and Edelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>Поляризационный световой</td><td>микроскоп Микроскоп Центральный</td><td>1100100402241</td><td>Используется для более четкого обзора дрозофилы во время определения пола</td></tr><tr><td>ProPette Pipette Tips</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>ProPette Pipette Tips</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>ProPette Pipette Tips</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>Пропионовая кислота</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>Вискозные шарики</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>Рейнольдс обертка стандартная алюминиевая фольга</td><td>Скобы</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>жаровни Духовка (мультиварка)</td><td>Hamilton Beach</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>Скотч 810 Волшебная лента</td><td>Электронная микроскопия науки</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>Пульверизатор с триггером</td><td>US Пластик</td><td>66446</td><td>Используется для распыления этанола для очистки рабочих мест изгибов</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Инкубатор дрозофилы</td><td>Thermo Scientific</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco 4 градуса Лабораторный холодильник</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>Лабораторный морозильник Revco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

Циркадная обучение Дрозофилы Меланогастер

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Почти универсальные среди организмов циркадные ритмы координируют биологическую активность на околоземной орбите вокруг Солнца. Для выявления факторов, создающих этот ритм, и для понимания полученных результатов требуется увлечение модельных организмов определенными циркадными точками времени. Здесь мы подробно процедуры для окутывать многие Drosophila в определенный циркадный ритм. Кроме того, мы подробно описаны шаги после вовлечения для подготовки образцов для иммунофторесценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка.

Контролируемое циркадные обучения позволяет исследователям изучать биологию в определенных точках времени в течение циркадного дня с помощью графиков времени ЗТ1-ЗТ19 или при необходимости добавлять точки времени. Здесь мы используем свет и тьму, чтобы уведить мух до циркадных циклов и проверить увлечение иммуноблоттингом и иммунофлуоресценцией анализа белка периода, маркером циркадного обучения(рисунок 1). При правильном затренчении, период белки должны иметь характерную интенсивность и подвижность картины (Рисунок 1A) и должны быть видны в определенных местах в мозгеNo 1 (рисунок 1B). Хотя другие переменные, включая пищу и температуру, могут влиять на циркадные обучения, свет является наиболее простым и надежным дляуправления 17. Для целей этих методов, температура инкубатора держится постоянн, полагаясь на нейроны часов мозга которые повлияно на светом для entrainment18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg"> Рисунок 1: Проверка натренированности. (A)Иммуноблотирование экстрактов целых клеток, подготовленных из головок обученных мух, показывает канонические закономерности подвижности и интенсивностибелка периода 19. 1.4 женские головки от каждого из показанных времен zeitgeber (ЗТ) были проанализированы используя антитело anti-Per. (B) Иммунофлуоресценция перенапряженного мозга, собранного в ЗТ, где белок периода находится в характерном рисунке (нижние панели, воссозданные из Helfrich-Forster20). Показаны изображения, взятые из различных разделов мозга, захватив все нейроны, как ожидается, содержат белок периода на ЗТ1. Шкала бар составляет 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ЗТ1</td>
			<td>ЗТ7</td>
			<td>ЗТ13</td>
			<td>ЗТ19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Свет с 10:00 до 22:00</td>
			<td>Свет с 10:00 до 22:00</td>
			<td>Темно с 9 утра до 9 вечера</td>
			<td>Темно с 9 утра до 9 вечера</td>
		</tr>
<tr>
<td>Собрано в 11 утра после 1 часа в свете</td>
			<td>Собрано в 17:00 после 7 часов в свете</td>
			<td>Собрано в 10 утра после 1 часа в темноте</td>
			<td>Собрано в 16:00 после 7 часов в темноте</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Графики времени циркадного ритма NO1-ЗТ19.

Здесь мы подробно, как синхронизировать Drosophila в циркадный день. Это первый и самый важный шаг, необходимый для изучения биологических ритмов и хронобиологии.

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Синхронизация дрозофилы для определения циркадных времен является первым шагом в изучении событий, которые либо контролируют, либо реагируют на биологические часы. Синхронизация всех моделей будет следовать одному и тому же базовому подходу. Есть много шагов, чтобы сделать это практично, и это может показаться подавляющим, чтобы положить их все вместе.Ожидайте попробовать несколько раз, прежде чем он чувствует себя естественно. Держите температуру стабильной, и я хочу, чтобы свет в течение трех минут шаги. Подготовка пищи мухи в Крок-Пот при 121 градусов по Цельсию, смешивания в качестве ингредиентов добавляются.Обложка Крок-Пот и довести содержимое до кипения, смешивая содержимое каждые 10 минут. Через 20 минут на катящийся кипяток, выключите огонь, и добавить 83,6 миллилитров воды в Крок-Пот. Оставьте крышку, как пища охлаждается.Пока пища охлаждается, перемешайте ее каждые 10 минут, чтобы не позволить пленке сформироваться на вершине. Также измеряйте температуру каждые 10 минут со стеклянным термометром. После того, как пища остынет ниже 60 градусов по Цельсию, добавьте тегосепт и пропионовую кислоту, как описано в рукописи.Хорошо перемешать и настроить Крок-Пот для поддержания температуры, всего на несколько градусов меньше, чем 60 градусов по Цельсию. Используйте перистальтический насос для распределения пищи мухи. Для узких флаконов, насос 10 миллилитров, а для шести унций квадратных нижних бутылок, насос 60 миллилитров.Храните диких мух типа при 25 градусах по Цельсию в течение 10 до 12 дней, пока около 200 куколок не будут прикреплены к внутренностям бутылки. Чтобы удалить взрослых из бутылки, наконечник их в новую бутылку, и использовать скучный конец числа нулевой кисти, чтобы подтолкнуть всех оставшихся взрослых дюйма Протрите кисть 70%этанолом до и после использования.Инкубировать куколки при 25 градусах по Цельсию, чтобы следующее поколение, чтобы выйти. Через три дня мухам будет от нуля до трех дней. Помните, что температура, свет, и даже ваш выбор пищи будет влиять на увлечение.Будьте уверены, чтобы сохранить их, каждый контроль во время эксперимента. В назначенное время для сбора, использовать углекислый газ анестезии площадку для обездвиживания мух, и собирать 100 мужчин и 100 женщин. Самки мух намного крупнее самцов.Мухи также могут быть дифференцированы путем изучения гениталий. Мужчины имеют темные округлые гениталии, в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Поместите самцов и самок в отдельные флаконы со 100 самками на флакон и 50 самцами на флакон.Мужские социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Для того, чтобы циркадные увлечение происходит, поместите флаконы в свет регулируется инкубаторов в течение трех-пяти дней. Для производства мух для будущего вовренирования поместите 25 оставшихся самок и пять-семь оставшихся самцов в новую бутылку.Инкубировать бутылку при 25 градусах по Цельсию. На каждые 100 мух, которые будут собраны. Подготовьте узкий флакон, добавив 4,8 миллилитров фиксатора.Поместите узкие флаконы в ведро со льдом и возьмите ведро, бумажные полотенца, фольгу и ленту к инкубатору. Чтобы собрать мух, поместите воронку в узкий флакон, затем снимите крышку с флакона мух и быстро переверните ее в воронку. Нажмите осторожно, чтобы помочь направлять мух во флакон фиксатора.Собирая самцов, смешайте два флакона по 50 мух в один узкий флакон. Оберните флаконы для ЗТ13 и ЗТ19 в фольгу. После передачи мух, лента шапки на месте, чтобы избежать разлива.Поместите флаконы на Nutating Mixer при 165 об/мин и четыре градуса по Цельсию в течение четырех часов. Мухи больше не светочувствительны, так что фольга может быть удалена, чтобы убедиться, что мухи погружаются в фиксатор. После удаления флаконов из Nutating Mixer, удалить формальдегид, а затем мыть мух три раза с 3000 микролитров 1X PBS, инвертирование флакона во время каждой стирки.Храните флаконы при четырех градусах по Цельсию, чтобы дождаться будущего иммунофлюоресценции. Свет и тьма использовались для того, чтобы перегнать мух в циркадные циклы. Энтрейнция была проверена иммуноблоттингом и иммунофлуоресценцией белка периода, маркером циркадного обучения.Иммуноблотинг экстрактов целых клеток, приготовленный из голов обученных мух, показывает каноническую закономерность подвижности и интенсивности белкового периода. Иммунофлуоресценция перенапряженного мозга, собранная при ЗТ1, показывает периодовые белки в характерной структуре. Этот метод является прыжки с точки для иммунофлуоресцентных, иммуноплоттинг, иммунопреципиентность, поведенческий анализ, и любой другой метод, который вы можете использовать, чтобы сравнить, как путь изменения, как биологические часы клещей.С возможностью увязать ваш модель организма, вы можете спросить, если ваш любимый путь меняется с течением времени, и является ли эффект в вашем любимом пути может привести к нарушению биологического. Ряд заболеваний усугубляется, когда биологические часы нарушается. Выявление основных механизмов поможет нам создать более эффективные лекарства для людей, страдающих от таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Мы описываем процедуры регистрации ежедневной двигательной активности...

Опробование двигательную активность по изучению циркадные ритмы сна и параметров в Drosophila</em

В этом видео описывается система мониторинга активности дрозофилы (DAM), используемая для отслеживания двигательной активности. Исследователи используют данные об активности, собранные с помощью DAM, для изучения циркадных ритмов у плодовых мушек. В ролике с протоколом показано, как загружать мух в устройство и записывать данные об активности для циркадных экспериментов.

дрозофила Монитор активности (DAM): метод измерения локомоторной активности у мух

Здесь мы опишем свет-темнота предпочтение тест на личинки дрозофилы. Этот препарат обеспечивает информацию о врожденных и регулирования циркадных светочувствительных и обработки photobehavior.

Свет Анализ предпочтений по изучению врожденных и суточного Регулируемые Photobehavior в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

Недавно мы определили роман Drosophila циркадный выход, ритм предпочтения температуры (TPR), в котором предпочтительная температура у мух поднимается в течение дня и падает в ночное время. TPR регулируется независимо от другого циркадного производства, локомотивной деятельности. Здесь мы описываем дизайн и анализ TPR в Drosophila.

Дизайн и анализ поведения предпочтения температуры и его циркадный ритм в Drosophila

В этом отчете описывается метод измерения активности личинок дрозофилы с помощью TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Устройство использует инфракрасные лучи для обнаружения движений до 16 отдельных животных. Данные могут быть проанализированы для представления параметров движения, включая скорость и положение животных в пробирных камерах.

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Влияние генов и окружающей среды на социальное пространство Drosophila melanogaster может быть количественно определено с помощью мощной, но простой аналитической парадигмы. Здесь мы показываем различные факторы, которые могут влиять на это социальное пространство, и поэтому должны быть приняты во внимание при планировании экспериментов в этой парадигме.

Условия, влияющие на социальное пространство в<em&gt; Дрозофилы</em

Представлен метод количественной оценки временные особенности видели в летать суточный ритмы опорно. Количественная оценка достигается путем установки летать деятельность с несколькими параметрической модели сигнала. Параметры модели описывают форму и размер утром и вечером вершины повседневной деятельности.

Вычислительный метод для количественного определения летать суточного деятельности

Цель настоящего Протокола заключается в создании ex vivo дрозофилы личиночной мозга культуры оптимизированы для мониторинга суточного молекулярной ритмы с долгосрочным флуоресценции покадровой изображений. Также обсуждается применение этого метода для фармакологических проб.

Одноклеточных резолюции флуоресценции живут изображений дрозофилы суточного часов в культуре личиночной мозга

В этой статье мы показали, как рассекают центральной нервной системы с третьего возраста личинок дрозофилы.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

Исследование сложного поведения в...

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Узнайте метод синхронизации Drosophila melanogaster для исследования циркадных ритмов и хронобиологии. Этот подход позволяет изучать влияние биологических часов на физиологические процессы и поведение.

Циркадная обучение Дрозофилы Меланогастер

Больше видео