Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro

Дифференцировка нейронов из анализов у мышей является отличной моделью для иллюстрации ключевых механизмов, участвующих в нейрогенезе. Мы демонстрируем оптимизированный метод эмбриоидного нейрогенеза с использованием стратегии тороскрининга компании. Эта методика обладает такими преимуществами, как высокая эффективность, низкая стоимость и простота в эксплуатации, а также подходит для популяризации среди лабораторий.

Это мощный инструмент для исследований в области нейробиологии. Чтобы выполнить дифференцировку с использованием протокола 1, засейте 20 000 эмбриональных стволовых клеток мыши в два миллилитра базальной дифференцировочной среды в каждую лунку шестилуночного планшета, покрытого желатином толщиной 0,1%. После прикрепления клеток промойте клетки двумя миллилитрами PBS и добавьте в каждую лунку по два миллилитра среды базальной дифференцировки, затем поместите клетки обратно в инкубатор.

Дайте клеткам дифференцироваться в течение восьми дней, заменяя среду каждые два дня. Чтобы выполнить второй протокол, добавьте 1,5 миллиона эмбриональных стволовых клеток мыши в неадгезивную бактериальную чашку в 10 миллилитров базальной среды для дифференцировки и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить образование эмбриоидного тела. Через два дня переложите клеточные агрегаты в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров и дайте им отстояться под действием силы тяжести.

Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров свежей среды базальной дифференцировки для повторного суспендирования эмбриоидных тел. Затем пересадите их в новую неклейкую посуду и выдержите еще два дня. Соберите и засейте около 50 эмбриоидных тел в двух миллилитрах базальной дифференцировочной среды на лунку на шестилуночный планшет, покрытый желатином.

Для индукции ретиноевой кислоты добавьте два микролитра бульона RA в каждую лунку до конечной концентрации в один микромоляр. Верните планшет в инкубатор и дифференцируйте клетки еще четыре дня. Чтобы выполнить дифференцировку с использованием третьего протокола, повторите второй протокол, но оставьте только два дня для формирования эмбрионального тела и шесть дней для индукции РА.

Контроль качества формирования эмбриоидных тел должен проводиться с помощью микроскопии. Только те, у кого яркие ядра, могут успешно дифференцироваться в последующем процессе. Для четвертого протокола засейте 20 000 эмбриональных стволовых клеток мыши в лунку в пластины, покрытые желатиновым покрытием, и следуйте первому протоколу.

Дав клеткам дифференцироваться в течение четырех дней, добавьте по два микролитра всего запаса транс-РА в каждую лунку и инкубируйте планшет еще четыре дня. Чтобы выполнить пятый протокол, повторите четвертый протокол, но начните индукцию РА уже через два дня дифференцировки. Для Протокола 6 поместите 1,5 миллиона стволовых клеток в неадгезивную бактериальную чашку в 10 миллилитров среды N2B27 и инкубируйте планшет при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить образование эмбриоидного тела.

Через два дня соберите клеточные агрегаты, как описано ранее, и повторно суспендируйте эмбриоидные тельца 10 миллилитрами свежего N2B27 среднего размера. Пересадите их в новую неадгезивную бактериальную посуду и дайте дифференцировке еще два дня. На четвертый день соберите и посадите около 50 эмбриоидных тел в лунку на покрытые желатином шестилуночные планшеты с двумя миллилитрами N2B27.

Добавьте по два микролитра всего запаса транс-РА в каждую лунку и вызывайте дифференцировку в течение еще четырех дней. Чтобы выполнить седьмой протокол, засейте около 20 000 клеток в двух миллилитрах базальной дифференцировочной среды на лунку на пластины, покрытые желатином. После присоединения клеток и двух промываний PBS добавьте по два миллилитра среды N2B7 по два в каждую лунку и дайте клеткам дифференцироваться в течение восьми дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе.

После проведения первой фазы дифференцировки с использованием протокола 3 засейте около 500 000 производных эмбриональных стволовых клеток мыши в 2 миллилитра базальной дифференцировочной среды на лунку на планшеты, покрытые 0,1% желатином. Случайным образом разделите производные на три группы, чтобы протестировать три протокола второй фазы дифференцировки. Инкубируйте планшет в течение шести часов, затем дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS и добавьте в каждую лунку по два миллилитра среды базальной дифференцировки N2B27 medium one или N2B27 medium two, в зависимости от протокола.

Поместите лопасти в инкубатор и дайте клеткам дифференцироваться еще 10 дней, меняя соответствующую среду каждые два дня. Было протестировано семь протоколов для определения оптимального протокола для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в обычные клетки-предшественники или NPC. Протоколы были протестированы на обоих замках A2lox и 129 клетках, а статус дифференцировки каждой группы контролировался с помощью светового микроскопа.

Большинство производных A2lox и 129 показали хорошо сложенную и нейритоподобную морфологию в соответствии с третьим протоколом, что указывает на образование NPC. Однако клетки, дифференцированные по второму протоколу, оказались апоптотическими, что может быть связано с недостатком питательных веществ в эмбриоидных телах. Для дальнейшего подтверждения образования NPC были обнаружены нестин-положительные клетки с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

Протокол 3 привел к наибольшему проценту нестин-положительных клеток, достигающему 78 и 69% в A2lox и 129 производных соответственно. Были протестированы три протокола для дифференцировки NPC в нейроны. Было установлено, что протокол три наиболее эффективно индуцирует дифференцировку.

Большинство производных A2lox и 129 в третьей фазе имели протяженные нейроноподобные структуры с четкими нейритами и расширениями клеточного тела. Иммунофлуоресцентные анализы также подтвердили генерацию нейронов с процентным содержанием бета-тубулина в трех положительных клетках до 68 и 59% в A2lox и 129 производных соответственно с использованием протокола 3. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что анализы мышей здоровы и недифференцированы перед дифференцировкой.

Кроме того, строгий контроль качества должен проводиться после формирования в буровых телах и перед дифференциацией второй фазы. Этот метод обеспечивает стандартную модель для исследователей нейробиологии и биологии развития и, как ожидается, станет мощным инструментом для иллюстрации ключевых механизмов, участвующих в нейрогенезе.