Магнитные, акустические и оптические тройные микропузырьки для магнитной гипертермии и пототермической комбинированной терапии рака

Этот протокол имеет большие перспективы для улучшения пост-наномедицины и противораковой эффективности наночастиц в лечении рака. Этот метод объединяет магнитную, акустическую и оптическую реакцию в одну нанотерапевтическую платформу для контроля и адресной доставки нанолекарств, а также облегчает комбинацию фототермической и магнитной гипертермической терапии. Демонстрировать процедуру будет Сию Ванг, специалист по магнитным, акустическим и тройным оптическим микропузырькам для магнитной гипертермии и фототермической комбинированной терапии рака из моей лаборатории.

Для образования микропузырьков в оболочке из наночастиц равномерно диспергируйте магнитные наночастицы оксида железа в деионизированной воде для получения исходного раствора 10 миллиграммов на миллилитр и загрузите раствор наночастиц в ультразвуковую очистительную машину на 20 минут. В конце ультразвуковой обработки добавьте 150 микролитров деионизированной воды, 150 микролитров 10 миллимолярного додецилсульфата натрия и 400 микролитров раствора наночастиц оксида железа ультразвуком в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Далее закрепите гомогенизатор с помощью скаффолда в ледяной бане и поместите раствор наночастиц в ледяную ванну.

Погрузите зонд гомогенизатора в раствор наночастиц и гомогенизируйте суспензию на три минуты со скоростью 20 000 оборотов в минуту. В конце гомогенизации дайте раствору стабилизироваться в течение 12 часов при комнатной температуре, прежде чем поместить трубку в магнитный держатель для адсорбции микропузырьков, покрытых наночастицами, на стенке трубки. Замените надосадочную жидкость одним миллилитром свежей деионизированной воды три раза, чтобы промыть микропузырьки, покрытые наночастицами.

После последней промывки слегка встряхните тюбик и переложите 10 микролитров микропузырьков, очищенных от наночастиц, на чистое предметное стекло. Используйте флуоресцентный микроскоп и 20-кратное увеличение для получения изображения микропузырьков, покрытых наночастицами. После получения изображения откройте изображение в программном обеспечении микроскопа и с помощью линейки установите красную линию той же длины, что и линейка.

Нажмите кнопку «Установить и масштабировать», чтобы ввести длину линейки и нарисовать линии той же длины при диаметре не менее 200 отдельных микропузырьков. Затем нажмите «Отчет» и «Просмотреть отчет». Чтобы измерить акустический отклик микропузырьков, разведите 200 микролитров микропузырьков, очищенных наночастицами, в 800 микролитрах деионизированной воды в трубке объемом 1,5 миллилитра и подключите генератор функций, усилитель, согласование импеданса и самодельный преобразователь фокусировки.

Поместите датчик в центр дна искусственной кубоидной раковины и подключите гидрофон к осциллографу для контроля интенсивности выходного ультразвука. Добавьте достаточное количество деионизированной воды, чтобы погрузить датчик в воду, и отрегулируйте генератор функций в режим развертки. Настройте диапазон частот от 10 до 900 килогерц и установите амплитуду на 20 напряжение от пика до пика.

С помощью усилителя отрегулируйте мощность ультразвука на 0,1% и продолжительность цикла на четыре секунды с интервалом в одну секунду. Поместите трубку с наночастицами в каркас в верхней части самодельного преобразователя фокусировки и прикрепите магнит к нижней части трубки. Включите генератор функций и питание усилителя.

После пяти 25-секундных ультразвуковых циклов выключите генератор функций и снимите магнит. Затем замените раствор наночастиц одним миллилитром деионизированной воды и повторите ультразвуковое исследование и обработку. Чтобы настроить лазер на оптическую обработку микропузырьков, сначала включите источник питания лазера.

Через несколько минут закрепите волоконно-оптический лазерный диод 808 нанометров на ретортной стойке и с помощью оптического волокна направьте лазерный луч на предметный столик образца. Используйте выпуклую линзу для фокусировки на предметном столике, чтобы получить световое пятно диаметром шесть миллиметров, и измерьте выходную мощность с помощью измерителя мощности лазера. Затем отрегулируйте мощность с точностью до одного ватта на квадратный сантиметр.

Для проведения фототермического измерения необходимо подготовить объем одного миллилитра наночастиц оксида железа различной концентрации в отдельных центрифугах объемом 1,5 мл и поместить первую пробирку в сфокусированную область лазерного луча. Запишите базовую температуру образца и включите лазерную и инфракрасную тепловизионную камеру. Непрерывно облучайте образец в течение 10 минут, регистрируя температуру в режиме реального времени.

Затем выключите лазер и камеру и подождите, пока температура области вернется к исходному уровню, прежде чем измерять концентрации других образцов таким же образом. Для измерения магнитной гипертермии в водном растворе приготовьте различные разведения наночастиц оксида железа, как показано на рисунке, и поместите одно разведение в центр медной катушки с холодной магнитной индукцией. Включите переменное магнитное поле и инфракрасную тепловизионную камеру и непрерывно наводите образец в течение 10 минут, регистрируя температуру в режиме реального времени.

По окончании процедуры выключите переменное магнитное поле и камеру. Когда температура медной катушки вернется к исходному уровню, измерьте следующий образец. Микропузырьки, покрытые наночастицами, обычно имеют сферическую форму со средним диаметром около 5,41 микрометра.

Хотя микропузырьки остаются неповрежденными в течение года, ступенчатое высвобождение железа может быть достигнуто за счет увеличения количества ультразвуковых циклов. Фототермическое измерение наночастиц оксида железа в водном растворе показало быстрое повышение температуры наночастиц оксида железа с течением времени при повышении температуры на 30 градусов Цельсия, достигаемом после 10 минут воздействия лазерного света ближнего инфракрасного диапазона при концентрации железа 5 миллиграммов на миллилитр. По сравнению с контрольной группой, при инкубации клеточных линий рака молочной железы с высокой концентрацией железа не наблюдается различий в морфологии или количестве живых клеток, что свидетельствует о хорошей биодоступности наночастиц оксида железа.

После облучения обработанные наночастицами раковые клетки приобрели округлую форму и продемонстрировали сниженную жизнеспособность, что указывает на апоптоз. Через пять минут после облучения температура в местах инъекций желатина быстро повышается примерно на 20 градусов Цельсия. При воздействии терапии переменным магнитным полем тепловизионное изображение различных концентраций наночастиц оксида железа выявляет переменную реакцию магнитного поля, характерную для микропузырьков, покрытых наночастицами.

Кроме того, массовая визуализация мышей, подвергшихся терапии переменным магнитным полем, показывает значительные быстрые изменения температуры в области интереса. Во время перемешивания раствора наночастиц следите за тем, чтобы зонд гомогенизатора оставался полностью погруженным в раствор. Этот протокол также может обеспечить и улучшить проникновение в опухолевые ткани для решения проблем доставки наномедицины в лечение рака.