Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка

Текущие протокольные оценщики в текстильном, редоксном состоянии меняются внутриклеточным отсеком. Наш протокол позволяет лучше понять и контролировать все физиологические или патофизиологические механизмы окислительного стресса. Этот метод позволяет не-разрушительной количественной оценки соотношения сульфида глаза в нетронутых клетках, используя соотношение метрических выходных, чтобы уравновесить различия между уровнями выражения сигнала, отбеливание фото, и обнаружение чувствительности.

Этот протокол может быть применен к различным организмам, в том числе бактерий в растениях. В первый день эксперимента лечить клетки из стеченной линии раковых клеток молочной железы в течение двух минут, с двумя миллилитров 0,2, 5%поездки в ЭДТА. Когда клетки начинают отделять арест реакции с шестью миллилитров полной среды и осадок клеток центрифугации.

Повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров свежей, полной среды, подсчитайте клетки и разбавьте их в 1,5 раза от 10 до пятых клеток на один миллилитр полной среды. Затем семена 1,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр клеток на колодец в 6 хорошо пластины, и инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток на ночь. Или не добавляйте вирусный ряд GFP трансдукции.

На следующее утро, добавить 12,5, 25 и 50 микролитров от одного до 100 разбавленных шесть раз 10 до 10-й бляшки формирования единиц на миллилитр добавить не вирусный раствор Эстры GFP, в полной среде. Добавьте это в соответствующие скважины или 6 скважин пластины для трансдукций клеток с 50, 100 и 200 умножений инфекции, соответственно. Когда все образцы Скважины были перенесены с вирусом, вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 16 до 24 часов.

На следующий день визуализировать клетки с помощью микроскопии флуоресценции и заменить супернатант со средним, без вируса, чтобы клетки восстановиться в течение еще 24 часов. Для определения оптимальной эффективности трансдукции оцените интенсивность флуоресценции и морфологию клеток по цитометрии потока. Не забудьте провести все процедуры, которые могут вызвать инфекцию от аэрозолей или брызг в биобезопасности уровне два сертифицированных биологической безопасности кабинета.

Чтобы оценить состояние редокса клеток, на следующее утро, инкубировать клетки и соответствующие Уэллс 6 хорошо пластины с 10 микромолярной перекиси водорода в течение одного часа, прежде чем отделить клетки с 750 микролитров 0,2 5% капает в ЭДТА на колодец, как попродемонстрировано. Остановить реакцию с двумя миллилитров полной среды на колодец и тянуть supernatants для каждого состояния в отдельных 15 миллилитров конических труб. Осадок клеток центрифугации и мыть гранулы в 500 микролитров PBS на колодец центрифугации в два раза.

После второй стирки, фильтровать подвески клетки через 40 микрометр сетки в поток цитометрии совместимых труб на льду, защищенных от света. В программном обеспечении цитометра Потока запустите нулевую множественность образца инфекционного контроля. Затем проанализируйте перекись водорода и необработанные клетки.

Это позволит вычислить среднее соотношение флуоресцентной интенсивности между окислеными и уменьшенными формами строки GFP, используя формулу, как указано. Вот стратегия gating для выбора большого количества клеток по цитометрии потока показано. Цитометрия потока также может быть использована для определения кривой реакции дозы для анализа строки GFP и наиболее эффективного многообразия ввода инфекции.

Согласно множественности инфекции, кривой реакции дозы в этом репрезентативном анализе, 200 множественность инфекции дала самое высокое выражение GFP дороги, но морфология клетки была назойливой предлагая цитотоксичность. Таким образом, оптимальная эффективность трансдукции была определена как множественность инфекции 100. В этом анализе статуса редокса, окислено и уменьшенный ряд GFP означает флуоресценции интенсивности были получены из потока цитометрии анализа для транспортного средства и четыре 10 микромоляных положительный контроль перекиси водорода лечения.

Наложенные гистограммы представляют сдвиги в количестве клеток в 10 микромоляных перекиси водорода и обработанных транспортным средством групп или уменьшенных и окислимых размывают GFP. Расчет соотношения между окисляемой и уменьшенной строкой GFP для этого анализа показал, что 10 микромоляных перекиси водорода вызвали трехкратный рост окисления ряда GFP по сравнению с обработкой транспортного средства. Наличие точных номеров клеток имеет важное значение для расчетов МРТ и воспроизводимости.

Для того, чтобы иметь воспроизводимые результаты, исследователи должны тщательно смешивать противовирусные растворы для получения однородных суспензий. Этот протокол позволяет исследователям изучать быстрые изменения редокса как неотъемлемую часть широкого спектра нормальных клеточных процессов и прогрессирования заболевания в режиме реального времени.