Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Этот протокол может быть применен к любому процессу, что приводит к двойным мель ДНК перерывов, дает подробные количественные данные по кинетике. Хотя этот метод имеет разрешение одной молекулы, он измеряет до 1000 ДНК в одном эксперименте, обеспечивая тем самым хорошую статистику. Основным применением этого метода является изучение механизмов, участвующих в связывании и модификации ДНК.

Например, мы заинтересованы в изучении целевого поиска ДНК, который имеет отношение ко всем связывающим белкам ДНК. При попытке этой техники в первый раз, помните, что одна молекула тросы деликатный, и как только форма, должны быть обработаны с осторожностью. Правильная доля функциональных поверхностей имеет важное значение.

Есть несколько трюков для принятия потока так. Помимо переключения пробных трубок во время сбора данных, визуальная демонстрация может помочь тому, кто является новым для этой процедуры. Чтобы вымыть крышку скользит, поместите их в окрашивание банки и sonicate их с этанолом в течение 30 минут.

Тщательно промойте их деионизированной и дистиллированной водой, затем погрузите их в один молярный гидроксид калия и sonicate их еще 30 минут. Повторите последовательность стирки, убедившись, что для полоскания крышки скользит с водой после каждой стирки. Храните очищенную крышку скользит в окрашивание банки с водой.

Используйте чистую бритву, чтобы сократить восемь сантиметров в длину погрузки и выхода труб, и вставить их в отверстия в чистом стеклянном слайде. Epoxy трубки и пусть вылечить в течение пяти минут, чтобы обеспечить его. Нанесите двустороннюю ленту предварительно вырезать с узором канала на стеклянные слайды, и сгладить его с пластиковыми типсами для достижения хорошего уплотнения.

Очистите отступить от ленты, и применить чистую крышку скольжения, сглаживая его с типсами. Затем, эпоксидной кромки крышки скольжения, чтобы запечатать поток ячейки и дайте ему вылечить. Подготовь помеченную ДНК для привязывания, выполняя ПЦР в соответствии с рукописными указаниями.

Затем очистите продукт PCR с помощью комплекта очистки ПЦР. Приготовьте 10 миллилитров буфера А и дегазации его в вакуумном децикаторе, по крайней мере, на один час. Для функционализации потока ячейки, вводить 25 микролитров анти-digoxigenin и потрясающие фрагменты в PBS, в канал потока, используя гель загрузки отзыв, чтобы вписаться в PE60 трубки.

Инкубировать ячейку потока при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации вытяните 0,5 миллилитров буфера А через канал со шприцем, заботясь о том, чтобы не вводить воздух в канал. Затем гора поток ячейки на перевернутый микроскоп.

Подключите розетку к шприц-насосу и поместите входную трубку в трубку микро центрифуги, содержащую буфер A.Manually, потяните по крайней мере 0,5 миллилитров буфера А, чтобы промыть систему и загрунтовать насос. Затем дайте насосу работать на 10 микролитров в минуту, по крайней мере пять минут, чтобы уравночные системы. Vortex запас бутылку бисера, и пипетки 1,6 микролитров бисера в 50 микролитров буфера, а затем вихрь их снова.

Поместите бисер на магнитный сепаратор и пипетки из буфера. Повторно приостанавливайте их в 50 микролитров буфера А и вихрем их. После последней стирки повторно приостанавливаем бисер в 100 микролитров буфера А для окончательной концентрации 160 микрограмм на миллилитр.

Подготовка 480 микролитров 0,5 пикомолярного субстрата ДНК в буфере А и пипетки 20 микролитров суспензии шарика в разбавленную ДНК. Поместите смесь на ротатор в течение трех минут. После трех минут, немедленно загрузить образец в канал со скоростью потока 10 микролитров в минуту в течение 15 минут, или до тех пор, пока достаточно бисера привязывания наблюдается.

Вымойте канал всех свободных бусин, переключив входную трубку на свежую трубку буфера А, и пропуская его в 50 микролитров в минуту, по крайней мере 10 минут или до тех пор, пока свободные бусы не наблюдаются. И это полезно использовать стационарный клапан, чтобы отрезать поток и переключение труб. Переключение труб в одном гладком движении и убедитесь, что уровни жидкости в новых и старых пробных трубок совпадают, чтобы избежать обратного потока.

Перед сбором данных подготовьте правильную концентрацию фермента расщепления ДНК и вставьте в образец входную трубку. Опустите магнит над ячейкой потока. Установите насос для впрыски 80 микролитров образца на 150 микролитров в минуту и начать сбор данных.

Через минуту после сбора данных активируйте насос. Здесь показано репрезентативное изображение привязанных бусин до и после реакции. Анализ данных был проведен для количественной оценки количества шариков, оставшихся привязанными на протяжении всей реакции расщепления.

Этот метод был использован для измерения сайта конкретных ДНК расщепления ставки Nde1 для концентрации белка в диапазоне от 0,25 до четырех единиц на миллилитр, и две различные концентрации магния. Каждое условие было воспроизведено по крайней мере дважды, с несколькими 100 до 1000 привязали ДНК за эксперимент. При достаточно низких концентрациях белка скорость пропорциональна белку и не зависит от магния.

При высоких концентрациях белка скорость зависит от магния, но не зависит от концентрации белка. При попытке этого протокола, имейте в виду, что пузырьки воздуха в трубе и поток канала может запустить эксперимент. Убедитесь в том, чтобы не допустить воздуха в линии при переключении труб, и дега все буферы перед использованием.

Метод привязывания позволяет исследовать влияние напряжения в ДНК на реакцию. Это может быть достигнуто путем изменения силы магнита или применения потока во время сбора данных.