Loop-Опосредованное изотермальное усиление для скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждение сальмонеллы от культурной изоляции

Этот метод Salmonella LAMP был включен в Бактериологическое аналитическое руководство FDA, как метод скрининга в пищевых продуктах животного происхождения, так и метод подтверждения любых предполагаемых изолятов сальмонеллы. Метод быстрый, надежный и надежный. По сравнению с ПЦР его основными преимуществами являются быстрое тестирование, простое оснащение, низкий процент ложноотрицательных результатов и гибкий рабочий процесс.

Быстрый скрининг на патогены, такие как сальмонелла, играет важную роль в быстром выявлении потенциально зараженного продукта и может предотвратить заболевания или вспышки среди людей и животных. Начните с подготовки матриц ДНК для анализа LAMP. Существует два типа образцов, используемых для создания шаблонов ДНК.

Чтобы приготовить шаблоны из образцов корма для животных, асептически взвесьте 25 граммов образца пищи в стерильный фильтр-пакет. Добавьте в пакет 225 миллилитров стерильной буферной пептонированной воды и инкубируйте его при температуре 35 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации перелейте один миллилитр с отфильтрованной стороны пакета в микроцентрифужную пробирку.

Центрифугируйте пробирку при 900 умноженных на G в течение одной минуты. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте образец при 16 000 умноженных на G в течение двух минут.

А чтобы сбросить надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах реагента для подготовки образца и нагрейте ее при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут в сухом тепловом блоке. Затем охладите образец до комнатной температуры и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Второй тип образца для этого анализа LAMP поступает непосредственно из предполагаемых культур сальмонеллы.

Чтобы приготовить матрицы ДНК, перенесите 500 микролитров ночной культуры сальмонеллы в микроцентрифужную пробирку и нагрейте ее в нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем охладите образец до комнатной температуры и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение, физически разделите области, используемые для приготовления LAMP Master Mix и добавления шаблонов ДНК.

Очистите рабочие поверхности изопропанолом и раствором для разложения ДНК и ДНК. Затем очистите пипетки и держатели полосок для пробирок. Разморозьте изотермическую мастер-смесь, 10X Primer Mix, молекулярную воду, положительную контрольную ДНК и матрицы ДНК при комнатной температуре.

Включите прибор LAMP и введите соответствующую информацию об образце. Приготовьте LAMP Master Mix в соответствии с указаниями на рукописи, быстро смешайте и центрифугируйте его, а затем распределите по 23 микролитра Master Mix в каждую лунку пробирки. Сделайте вихревыми движениями все матрицы ДНК и быстро центрифугируйте их.

Затем добавьте два микролитра матрицы ДНК в соответствующую лунку и плотно закупорьте лунку. Извлеките полоску пробирки из держателя и поверните ее, чтобы убедиться, что все реагенты скопились на дне пробирки. Загрузите полоску трубки в прибор LAMP и запустите работу LAMP.

Во время реакции LAMP коснитесь вкладок «Температура», «Усиление» и «Отжиг», чтобы увидеть динамические изменения различных параметров во время запуска LAMP. Результаты LAMP можно просматривать на приборной панели LAMP в режиме реального времени или с помощью программного обеспечения LAMP. Чтобы интерпретировать результаты на приборной панели, откройте интересующий вас прогон LAMP.

Обратите внимание на пять вкладок, связанных с каждым прогоном. Вкладки «Профиль» и «Температура» показывают запрограммированные и фактические температуры в пробоотборных лунках по мере протекания реакции LAMP. Вкладки «Усиление» и «Отжиг» показывают показания флуоресценции и изменения флуоресценции во время фаз «Усиление» и «Отжиг» соответственно.

Вкладка «Результаты» показывает табличное представление результатов LAMP, которое может быть интерпретировано в соответствии с указаниями рукописи. Второй способ просмотра результатов LAMP — использование программного обеспечения LAMP. Чтобы интерпретировать результаты с помощью программного обеспечения, нажмите на значок «Компьютер» на левой панели и перейдите к расположению файла, чтобы загрузить интересующий вас прогон LAMP.

Обратите внимание на семь вкладок, связанных с каждым прогоном. Вкладки «Профиль» и «Температура» показывают запрограммированные и фактические температуры в пробоотборных лунках по мере протекания реакции LAMP. Вкладки «Усиление» и «Скорость усиления» показывают показания флуоресценции и изменения флуоресценции во время фазы усиления.

Вкладки «Отжиг» и «Производные от отжига» показывают показания флуоресценции и изменения флуоресценции во время фазы отжига. На вкладке «Результаты» отображается табличное представление результатов LAMP. Есть четыре столбца: «Имя графика», «Номер скважины», «Имя скважины» и «Пиковое значение».

Показаны производные Amp Time и Anneal для всех восьми образцов. Результаты могут быть интерпретированы в соответствии с указаниями рукописи. Для отображения результатов анализа можно использовать приборную панель LAMP и программное обеспечение LAMP.

В этом цикле LAMP образцы с S1 по S6 представляют собой десятикратные серийные разведения Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, в диапазоне от 1,1 миллиона до 11 колониеобразующих единиц за реакцию. Положительным контролем, или PC, является Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 в концентрации 17 000 колониеобразующих единиц за реакцию, а контролем без матрицы, или NTC, является молекулярная вода. Лунка NTC имеет пустой Tmax и анальную температуру примерно 81 градус Цельсия на приборной панели LAMP, а также пустую Tmax и пустую температуру отжига в программном обеспечении LAMP.

Скважина положительного управления имеет Tmax 7 минут и 45 секунд и температуру отжига около 90 градусов Цельсия на обеих платформах. Образцы от S1 до S6 имеют Tmax от шести минут до 30 секунд и от 12 минут и 15 секунд, а температура отжига составляет примерно 90 градусов по Цельсию, что указывает на положительное обнаружение. LAMP очень эффективен и генерирует большое количество ДНК.

Поэтому крайне важно, чтобы для предотвращения перекрестного загрязнения использовались передовые лабораторные методы. Используйте аналогичные методы при создании шаблонов ДНК, так как обогащение из загрязненной пищи для животных может содержать высокий уровень сальмонеллы. Положительный результат скрининга образцов корма животных с помощью LAMP должен быть подтвержден путем выделения культуры в соответствии с процедурами, описанными в Бактериологическом аналитическом руководстве FDA.

Об отрицательных образцах можно сообщать как таковых. Включение этого метода LAMP в Бактериологическое аналитическое руководство FDA открывает путь к более широкому применению этой быстрой, надежной и удобной технологии в тестировании безопасности пищевых продуктов.