Name: Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Узнайте метод приготовления экстракта белка и ко-иммунопреципитации из Caenorhabditis elegans. Этот протокол позволяет исследовать взаимодействия белков в различных генетических фонах.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была частично поддержана Канзас ИНБРЕ, P20GM103418 Ли и Зиновьева и R35GM124828 в Зиновьева. Мы благодарим Мин Хана за щедрый обмен антителами против АЙН-1. Некоторые из штаммов, используемых в ходе этой работы были предоставлены Caenorhabditis Генетический центр (CGC), финансируемых NIH Управление по программам научно-исследовательской инфраструктуры (P40 OD010440).

1. Коллекция образцов червей
<ol><li>Семя смешанной стадии илисинхронизированы 13 червей на NGM твердых пластин при требуемой температуре и позволяют червей расти до желаемой стадии. Для базового роста и обслуживания C. elegans, пожалуйста, см. Stiernagle et al. и Порта-де-ла-Риваи др. 14,13.</li>
	<li>Соберите червей в 15 мл конической центрифуги трубки путем мытья червя пластин с буфером M9.</li>
	<li>Пеллет червей центрифугирование при 400 х г при комнатной температуре (RT) в течение 2 мин и отказаться от супернатанта. ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранул червя для приготовления экстракта составляет от 100 мл до 500 йл. Гранулы упакованных червей объемом 300 л рекомендуются для экспериментов по иммунопреципиентации ниже по течению и обычно дают 4,5 мг общего белка, в то время как гранулы в 500 л дают 7,5 мг общего белка.</li>
	<li>Выполните дополнительные 3-5 моет с буфером M9 (см. таблицу 1) или до тех пор, пока супернатант больше не облачно.</li>
	<li>Выполните одну окончательную стирку с ddH2O.</li>
	<li>Переместите гранулы червя в 1,5 мл микроцентрифуг трубки и спина вниз на 400 х г на RT в течение 2 мин. Отбросьте оставшийся супернатант, чтобы получить упакованные гранулы червя и приступить к извлечению подготовки. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Червь гранулы могут быть заморожены в жидком азоте немедленно и хранится при -80 градусов по Цельсию или в жидком азоте. Обратите внимание, что гранулы червя могут быть разморожены только один раз и не могут быть переоценены.</li>
</ol>2. Извлечение подготовки червя гранулы
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление экстракта должно проводиться на льду или при 4 градусах Цельсия.
<ol><li>Если заморожены, оттепель червь гранулы на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Если желаемый упакованный червь гранул размером 300 йл не был получен во время сбора образцов, несколько меньших гранул могут быть объединены до тех пор, пока достаточно материала присутствует для дальнейшей экстракции.</li>
	<li>Добавьте равный объем ледяного 2x лиза буфера (60 мМ HEPES, рН 7,4, 100 мМ хлорид калия, 0,1% Тритон X, 4 мМ хлорид магния, 10% глицерол, 2 мМТ СВ С ингибитором RNase, ингибитор протеазы и ингибиторы фосфатазы; см. Таблицу 1) и вихрь или пипетку вверх и вниз, чтобы смешать. Спин трубки (ы) вниз, чтобы собрать смесь в нижней части трубки.</li>
	<li>Переместите смесь в 1,5 мл без rNase трубку, содержащую металлические бусины (см. Таблица материалов)и положить образец в гомогенизатор бисерной мельницы (см. Таблица материалов) при 4 градусов по Цельсию. Убедитесь, что крышки трубки затягиваются и образцы сбалансированы внутри гомогенизатора.</li>
	<li>Гомогенизировать образец на самой высокой скорости (установка 12) в течение 4 мин.</li>
	<li>Удалите образец из бисера и поместите его в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Кроме того, магнит, обеспеченный гомогенизатором, может быть использован для удаления бисера из образца.</li>
	<li>Спин вниз экстракт на 19000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы прояснить экстракт белка.</li>
	<li>Перенесите супернатант в свежую трубку 1,5 мл на льду, избегая переноса белого, облачного осадка, который образуется поверх образца. Супернатант теперь является уточненным экстрактом. ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранить 10 йл очищенного экстракта, чтобы определить общую концентрацию белка.</li>
	<li>Используйте экстракт немедленно для следующих экспериментов или вспышки заморозить экстракт в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Экстракты могут храниться при сверхнизкой температуре (-80 градусов по Цельсию или жидкого азота в течение 6 месяцев). Замороженные экстракты могут быть разморожены один раз и не могут быть переморожены.</li>
	<li>Определите общую концентрацию белка экстракта с помощью набора анализа концентрации белка, совместимого с моющими средствами (см.таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.</li>
</ol>3. Иммунопреципиентация
ПРИМЕЧАНИЕ: Все иммунопреципиентные шаги для приготовления экстракта должны быть выполнены на льду или при 4 градусах Цельсия. Рекомендуется использовать 2 мг общего белка для каждого иммунопреципиентации. Тем не менее, были выполнены успешные иммунопреципитации с 0,8-1 мг общего белка. Всегда используйте свежие или свежеотмороженные белковые экстракты. Следующий протокол изложен для выполнения иммунопреципиентации от 2 мг общего белка, или одного эксперимента иммунопреципиентации. Количество бисера и антитела может быть увеличено или уменьшено соответственно для множественных образцов или если по-разному количество выдержки протеина использовано.
<ol><li>Поместите или оттаивать экстракт белка на льду. Образец можно разбавить до 10 мг/мл или 5 мг/мл с ледяным 1x буфером лиза (см. таблицу 1).</li>
	<li>Переусердуйтесь с магнитными бусинами путем инверсии и перенесите 150 МКЛ 50% бусинок в трубку 1,5 мл. Намагничить бисер на льду против магнитной подстоять в течение 1 мин или до тех пор, пока решение ясно. Отбросьте супернатант.</li>
	<li>Снимите трубку с магнитной подстоя и вымойте бусинку в 1x лизе буфера с помощью 2 томов (т.е. 300 МЛ) суспензии бисера. Повторите мыть 2x в общей сложности три моет.</li>
	<li>Перезагнете бисер в 150 МКЛ ледяного лиза буфера.</li>
	<li>Передача 75 л суспензии бисера на 2 мг экстракта белка и инкубации при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч с нежным возбуждением. Сохранить оставшиеся подвески шарика на льду для более длительного использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для уменьшения неспецифического связывания белка с бисером во время шага иммунопреципиентации.</li>
	<li>Поместите трубку с образцом на магнитном стенде на льду в течение 1 мин или до тех пор, пока шарики полностью намагничены и образец не будет ясен. Перенести супернатант на новую трубку 1,5 мл; не беспокоить бисер. Это предварительно очистимый белок лизат. Сэкономьте 10% выборки для анализа западных помарк.</li>
	<li>Добавьте 20 мкг очищенного антитела к предварительно очищенному лизату и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч с нежным возбуждением. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител, используемых для иммунопреципиентации специфичен для антител и белка и должно быть эмпирически определено для обеспечения эффективной иммунопреципиентации целевого белка.</li>
	<li>Добавьте оставшиеся 75 МКЛ предварительно промытой подвески бисера (шаг 3,5) в смесь антител/лизата и инкубировать в течение 1 ч при 4 градусах с нежным возбуждением.</li>
	<li>Поместите трубку в магнитную подсвечку на льду в течение 1 мин или до тех пор, пока шарики полностью намагничены и образец не будет ясен. Сохранить супернатант для анализа западной помарки (необязательно).</li>
	<li>Вымойте бисер, содержащий иммунопреципитат 3x в 450 мкл буфера мытья (30 мМ HEPES, рН 7,4, 100 мМ хлорид калия, 0,1% Тритон X, 2 мМ хлорида магния, 10% глицерол, 1 мМ ДТТ; см. таблицу 1) на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные мойки могут быть выполнены, если более строгие условия стирки являются предпочтительными.</li>
	<li>Resuspend шарик гранулы в 20 йл 2x SDS/ BME белка гель загрузки буфера (см. Таблица материалов) и денатуры путем кипения при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут до загрузки на SDS-PAGE гель. Кроме того, денатурированные образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев. ПРИМЕЧАНИЕ: Часть иммунопреципита бисера может быть сохранена для изоляции РНК вниз по течению, при желании.</li>
</ol>4. Обнаружение западными помарками образцов ИС
<ol><li>Загрузите образцы IP на гель SDS-PAGE (см. таблицу материалов). Избегайте передачи бисера, поместив IP трубки на магнитной подготе в течение 1 мин до аспирации образца.</li>
	<li>Выполните западные blotting15,16 иантитела окрашивания 16 со следующими изменениями: разбавить антитела ALG-117 1:500 в 5% обезжиренного сухого молока (NFDM); разбавить антителоHRPK-1 2 1:1,000 в 5% NFDM; и разбавить ain-1антитела 18 1:10,000 в 5% NFDM. Вторичные антитела (см. Таблицуматериалов) использовались в соответствии с инструкциями производителя.</li>
	<li>Обнаружить полосы с HRP основе хемилюминесценции (см. Таблицу материалов).</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li>
<li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRPK-1%2C+a+conserved+KH-domain+protein%2C+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li>
<li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li>
<li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li>
<li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer%3A+an+old+tool+for+a+new+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li>
<li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans%3A+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).</li>
<li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li>
<li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li>
<li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li>
<li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2%E2%80%99-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins%2C+miRNAs%2C+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
</ol>

Авторов нечего раскрывать.

C. elegans является отличной моделью для изучения фундаментальных вопросов в клеточной, молекулярной и биологииразвития 19. В дополнение к своей силе в качестве генетической модели системы, C. elegans является подлежен биохимических подходов, в том числе, но не ограничиваясь, белка иммунопреципиентации и ко-иммунопреципиентации. Одним из потенциальных препятствий при проведении иммунопреципиентных экспериментов является отсутствие антител, характерных для белков, представляющих интерес. Если антитела не доступны, пользовательские поликлональные или моноклональные антитела могут быть созданы. Тем не менее, последние инновации в технологии редактирования генома позволили исследователям быстро ввести мутации или тег эндогенных генов C. elegans 20,21, облегчая исследования, которые распутывают генетические, функциональные и физические взаимодействия между генами и закодированными белками. В частности, CRISPR/Cas9-опосредованная пометка генов C. elegans в эндогенных локусах снизила зависимость иммунопреципиентных экспериментов от наличия антител, сделав эксперименты по совместной иммунопреципиентации гораздо более осуществимыми. Гены C. elegans могут быть помечены различными тегами, начиная от флуоресцентных тегов, таких как GFP или mCherry, и до небольших тегов, таких как FLAG и HA. Антитела, распознающие эти метки, легко доступны на коммерческой основе, облегчая изучение белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентных подходов.
Представленный протокол, изложенный на рисунке 1,может быть выполнен для небольшого числа образцов или расширен, что позволяет одновременно готовить до 24 образцов. В то время как первоначальные характеристики белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентации обычно проводятся в условиях дикого типа в нормальных условиях выращивания, последующие исследования часто требуют тестирования белково-белковых взаимодействий в различных генетических фонов или в различных условиях роста. Возможность одновременно готовить несколько экстрактов экономит время и, что важно, обеспечивает согласованность подготовки экстракта между различными образцами. Отрицательный контроль всегда требуется, при этом идеальным элементом управления является нулевая мутация в гене, кодирующей иммунопрециализированный белок, представляющий интерес (см. рисунок 3 и рисунок 4 для примеров).
Этот протокол экстракта позволяет быстро готовить экстракт белка из образцов C. elegans и сравним с гомогенизацией на основе бисераzirconium 8. Гомогенизация бисера в целом может быть увеличена до нескольких одновременных препаратов образца с использованием различных гомогенизаторов бисерной мельницы или аналогичного оборудования. Некоторые более экономичные гомогенизаторы бисерной мельницы могут уменьшить количество образцов, которые могут быть обработаны одновременно, однако. Кроме того, представленный протокол экстракта совместим с подготовкой экстракта на основе dounce, что представляет собой экономичную альтернативу. Хотя различные гомогенизаторы бисерной мельницы не были протестированы, большинство из них, вероятно, будут совместимы с этим протоколом экстракта белка, до тех пор, как полное нарушение образцов C. elegans достигается.
Как представлено, этот протокол подготовки экстракта совместим с несколькими экспериментами вниз по течению, включаяиммунопреципиентность белка 2 и микроРНК выдвижной12 и позволяет вниз по течению сбора белков и РНК компонентов. Он также эффективно извлекает как ядерные, так и цитоплазмическиебелки (рисунок 2, рисунок 3и рисунок 4). Аналогичным образом, представленный протокол иммунопреципиентации позволяет РНК-изоляцию от связанных с белком иммунопреципиетов. В то время как протокол иммунопреципиентации был первоначально разработан для выявления взаимодействующих белков ALG-1, метод может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми белками, представляющими интерес. В самом деле, иммунопроципиентации условия, используемые работал одинаково хорошо для иммунопреципиентации ALG-1(рисунок 3) и HRPK-1 (Рисунок 4). Этот протокол является отличной отправной точкой для иммунопурификации РНК-связывающих белков. Вместе с тем следует отметить, что для других белков, представляющих интерес, могут потребоваться некоторые изменения в составе буфера. Изменения могут зависеть от физических и биохимических свойств белка интереса и должны осуществляться на каждом конкретном случае.
После того, как целевой белок (здесь, ALG-1 или HRPK-1) иммунопреципилитирован, западные blotting могут быть использованы для тестирования со-иммунопрецивитата для конкретных взаимодействующих белков.
Кроме того, копурифицированный иммунопреципитат может быть подвергнут анализу масс-спектрометрии для выявления всех мяуковых взаимодействующих белков. Подтвержденные взаимодействия совместного иммунопреципиентации могут быть изучены в различных генетических фонов или условий для выявления потенциальной регуляции конкретного взаимодействия. Например, для определения роли hrpk-1 в сборке ALG-1/AIN-1 miRISC, С копреципиентирование ALG-1-AIN-1 оценивалось как в фоновом режиме дикого типа, так и при отсутствии HRPK-1(рисунок 3). было установлено, что hrpk-1 может быть незаменим для взаимодействия ALG-1/AIN-12 (рисунок 3). Кроме того, технология редактирования генома CRISPR/Cas9 может быть использована для генерации мутаций удаления одной точки или домена в интересах белков. Повторное тестирование способности генерируемых мутантов к совоккупетит с их белка взаимодействующих может выявить, какие домены или остатки посредников физического взаимодействия. Такие будущие исследования могут дать бесценную информацию о механизме функции белка и регулирования. Эти подходы, в сочетании с силой генетики C. elegans, могут дать важное представление о фундаментальных молекулярных процессах, которые регулируют развитие животных и клеточной функции.

Определение макромолекулярных взаимодействий интересного белка может быть ключом к получению дополнительной информации о его функции. Иммунопреципиентация и эксперименты по со-иммунопреципиетации могут быть использованы для определения всего взаимодействия белка с помощью крупномасштабныхпротеомных подходов 1 или для конкретного тестирования способности белка совоккупляться с гипотетическим взаимодействователем. В C. elegans,оба метода были успешно использованы, чтобы узнать больше о деятельности различных белков, в том числе тех, которые тесно функционируют с микроРНК длярегулирования экспрессиигенов 2,3,4. Эксперименты по со-иммунопреципиентации имеют преимущество тестирования белково-белковых взаимодействий в их родной клеточной среде, но подготовка экстракта может быть сложной и трудоемкой. Необходим эффективныйлиз образца, но необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму нарушение белково-белковых взаимодействий. Методы, такие как douncing5, sonication6, Balch гомогенизации7, и циркония бисер-гомогенизации8,9 были использованы для успешного подготовки C. elegans общего белка экстрактов. Эти методы, за исключением гомогенизации бисера zirconia, имеют ограничения с точки зрения количества образцов, которые могут быть обработаны одновременно. Представлен альтернативный метод, который может быть легко масштабируется, чтобы обеспечить высокую пропускную способность, быстрый препарат экстракт белка из образцов C. elegans с последующим со-иммунопреципиетации. В частности, метод может подготовить до 24 образцов одновременно, значительно сократив время, необходимое для подготовки экстракта. В отличие от этого, например, douncing обычно позволяет только один образец подготовки за один раз. Этот метод экстракта может быть использован для подготовки экстрактов из любой стадии развития C. elegans.
Описанный является пошаговая процедура для сбора образцов животных, экстракт подготовки, иммунопреципиентации, а также представление западных blotting данных для подтверждения успешного стягивания белка и обнаружения со-иммунопрециплиатации белка интереса. Для демонстрации эффективности протокола были проведены два эксперимента по со-иммунопреципиентации между 1) микроРНК Argonaute ALG-1 и AIN-1, гомологом GW182; и 2) ALG-1 и HRPK-1, недавно выявленный взаимодействующих ALG-12. ALG-1 и AIN-1 являются основными белками, которые составляют микроРНК-индуцированного глушиния комплекса (miRISC) и взаимодействие между этими двумя белками хорошосоздана 10,11. Протокол подготовки экстракта был эффективен в эксперименте по совместной иммунопреципиентации ALG-1-AIN-1. Этот протокол также успешно подтвердил взаимодействие между ALG-1 и его недавно выявленным взаимодействутелем, HRPK-12.
Таким образом, рукопись описывает протокол подготовки экстракта C. elegans, который может быть расширен до одновременного процесса 24 образцов вместе с протоколом совместного иммунодефицита, который может быть использован для выявления новых или подтверждения гипотетизированных взаимодействий между белками. Протокол подготовки экстракта совместим с рядом экспериментов ниже по течению, включая иммунопреципиентированиебелка 2 и микроРНК стягивания12. Кроме того, протокол иммунопреципиентации может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессированными белками C. elegans в различных генетических предпосылках.

<table><tbody><tr><td>15 мл пробирка</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Буфер для проб</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>анти-AIN-1 моноклональное антитело</td>, <td>специально сгенерированное</td><td>н/д</td><td>STEP 4.2, см. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>анти-ALG-1 моноклональное антитело</td>, <td>специально созданное PRF& L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>анти-HRPK-1 моноклональное антитело</td>, <td>специально созданное PRF& L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A для иммунопреципитации</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>Ингибиторы протеазы без ЭДТА</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Антитела к GFP (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Рисунок 2</td></tr><tr><td>Глицерин</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Вторичное антитело против кролика у козы, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Вторичное антитело против крысы IgG (H+L) у козы</td>, <td>HRP Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Стол 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Хемилюминесцентный субстрат, 100 мл Набор</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Магния хлорид гексагидрат ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Стол 1</td></tr><tr><td>Сульфат магния безводный</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Стол 1</td></tr><tr><td>Микроцентрифужные пробирки, 1,5 мл</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 дикий тип</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 упаковка (1,5 мл)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Коктейль ингибиторов фосфатазы 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Коктейль ингибиторов фосфатазы 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Хлорид калия</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Одноосновной фосфат калия</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Набор для анализа белка RC DC I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>РНКазаOUT Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазы</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Хлорид натрия</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Таблица 1</td></tr><tr><td>Двухосновной фосфат натрия безводный</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Стол 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Стол 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>доступен по запросу</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>доступен по запросу</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>доступен по запросу</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от caenorhabditis elegans

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Методы со-иммунопреципиентации часто используются для изучения белково-белковых взаимодействий. Подтверждение гипотетизированных белково-белковых взаимодействий или выявление новых может дать неоценимую информацию о функции белка, представляющий интерес. Некоторые из традиционных методов приготовления экстракта часто требуют трудоемких и трудоемких методов. Здесь модифицированный протокол подготовки экстракта с использованием гомогенизатора бисерной мельницы и металлических бусин описывается как быстрая альтернатива традиционным методам приготовления белка. Этот метод подготовки экстракта совместим с исследованиями совместного иммунопреципиентации ниже по течению. В качестве примера метод был использован для успешного со-иммунопреципита C. elegans микроРНК Argonaute ALG-1 и двух известных взаимодействующих ALG-1: AIN-1 и HRPK-1. Этот протокол включает описание сбора образцов животных, подготовки экстракта, уточнения экстракта и иммунопреципиентации белка. Описанный протокол может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессируемыми белками C. elegans в различных генетических предпосылках.

Этот протокол (схема на рисунке 1) был успешно использован для получения C. elegans общего экстракта белка(рисунок 2) для вниз по течению иммунопреципибилизациинескольких белков 2 (Рисунок 3 и рисунок 4). Представленный протокол гомогенизатора бисероплетительной мельницы был сопоставим по суммарным извлечениям белка сметодами на основе дунса (рисунок 2)и эффективно извлеченным ядерным (COL-19:GFP(NLS) (рисунок 2)и цитоплазмическимибелками (рисунок 3 и рисунок 4). Одновременно было извлечено несколько образцов различных размеров(рисунок 2). Белки Argonaute взаимодействуют с членами белкового семейство GW182, образуя миРИСК, которые связываются с РНК-посланниками цели и подавляют ихэкспрессию 10. На рисунке 3 показана успешная ко-иммунопреципитация основных компонентов миРИСК ALG-1 и AIN-1, в соответствии спредыдущими отчетами 11,17. В последнее время были предприняты усилия по выявлению дополнительных белковых взаимодействующих ArgonauteALG-1 3, с тем чтобы узнать больше о том, как биогенез и активность микроРНК могут регулироваться вспомогательными факторами. РНК-связывающий белок HRPK-1 был выявлен в иммунопреципитатахALG-1 3. Это взаимодействие было недавно подтверждено в ответном эксперименте по иммунопреципиентацииHRPK-1 2. Представленные протоколы экстракта и иммунопреципиентации успешно восстановили ALG-1 в HRPK-1-специфических со-иммунопрециатетатах(рисунок 4). Кроме того, взаимодействие ALG-1-AIN-1 было протестировано на различных генетических фонов и HRPK-1 было показано, что ненужным для ALG-1/AIN-1 miRISCсборки 2 (Рисунок 3). Дополнительные цифры предоставляются, чтобы показать полную мембрану зондировать(Дополнительный рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Рисунок 1: Схема рабочего процесса для препарата экстракта C. elegans и иммунопреципиентации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Рисунок 2: Западное сравнение помарки ядерной локализованной GFP, COL-19::GFP (NLS), уровней в подготовленных и гомогенизированных образцах от 250 йл и 100 гранул червя. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Рисунок 3: GW182 гомолог AIN-1 со-иммунопрециатетов с ALG-1. Западные пятна для белков ALG-1 и AIN-1 в иммунопреципитатах ALG-1. На ко иммунопрецибилацию ALG-1/AIN-1 отсутствие hrpk-1 не повлияло. Входные данные - 10% ОТ ИС. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Рисунок 4: ALG-1 со-иммунопрециатирует с HRPK-1. Показана западная блоттинг для HRPK-1 и ALG-1 в иммунопреципитатах HRPK-1. Входные данные - 10% ОТ ИС. Указывает на антитела тяжелой цепи. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Буфер M9 (1 Л)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 мгСО4
</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>до 1 л</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x буфер лиза (5 мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (рН 7.4)</td>
			<td>200 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% ТритонX</td>
			<td>100 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% глицерол</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>до 5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Добавить свежие:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 МТТ</td>
			<td>20 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ингибитор протеазы без ЭДТА</td>
			<td>1 таблетка</td>
		</tr>
<tr>
<td>ингибитор фосфатазы коктейль 2</td>
			<td>100 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>ингибитор фосфатазы коктейль 3</td>
			<td>100 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x буфер лиза</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Разбавить 2x Lysis буфер с равным объемом ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Буфер мытья 10 мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (рН 7.4)</td>
			<td>300 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% ТритонX</td>
			<td>100 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 йл</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% глицерол</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>до 10 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 МТТ</td>
			<td>20 йл (добавить свежий)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Рецепты
Дополнительная цифра 1. Показаны полностью исследованные западные мембраны помарки, используемые для генерации рисунков 2-4. (A) Зондная мембрана для рисунка 2. Обратите внимание, что мембрана была разрезана, чтобы обеспечить одновременное зондирование для GFP и Tubulin, уменьшая общий размер помарки. (B) Зондная мембрана для рисунка 3. (C) Зондная мембрана для рисунка 3. «обозначает тяжелую цепь антител. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Этот метод описывает протокол для высокопровереного приготовления экстракта белка из образцов Caenorhabditis elegans и последующей ко-иммунопреципиентации.

Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Этот протокол предусматривает пошаговую процедуру сбора образца, приготовления экстракта и иммунопреципитации для подтверждения успешного вытягивания белка и обнаружения представляющих интерес ко-иммунопреципитированных белков. Приготовление белкового экстракта может быть выполнено на 24 образцах и совместимо с рядом последующих применений, включая эксперименты по иммунопреципитации и извлечению РНК. Этот метод может быть адаптирован для облегчения тестирования взаимодействий между двумя или более эндогенными, эндогенно мечеными или сверхэкспрессированными белками C.elegans в различных генетических фонах.Визуальная демонстрация этого протокола предназначена для того, чтобы исследователи чувствовали себя комфортно при приготовлении белкового экстракта и иммунопреципитации, в надежде побудить новичков использовать их в своих исследованиях. Чтобы собрать образец червя, сначала засемените смешанную стадию или синхронизируйте червей на твердых пластинах питательной среды для нематод при необходимой температуре и дайте червям вырасти до нужной стадии. В конце инкубации используйте буфер M9, чтобы промыть червей в коническую трубку объемом 15 миллилитров и гранулировать червей путем центрифугирования.В конце центрифугирования удалите надосадочную жидкость и промойте червей еще три-пять раз в свежем буфере M9 за одну промывку. Когда надосадочная жидкость перестанет мутнеть, проведите одну последнюю промывку двойной дистиллированной водой и переложите рассыпчатую гранулу червя в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Гранулируйте червей с помощью дополнительного центрифугирования и выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость для получения упакованной гранулы червя.Чтобы приготовить вытяжку из собранной гранулы червя, добавьте равный объем ледяного буфера для лизиса 2X к рекомендуемому объему гранулы объемом 300 микролитров и энергично перемешайте полученную суспензию. Поверните образец вниз, чтобы собрать смесь на дне пробирки, и перенесите содержимое пробирки в 1,5-миллилитровую пробирку без РНКазы, содержащую металлические шарики. Плотно закупорив пробирку, поместите образец в гомогенизатор бисерной мельницы при температуре четыре градуса Цельсия, следя за тем, чтобы образец был сбалансирован внутри гомогенизатора.Гомогенизируйте образец на максимальной скорости в течение четырех минут перед переносом образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра без гранул. Открутите образец для осветления белкового экстракта и перенесите надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую пробирку на льду, не перенося белый мутный осадок в верхней части образца. Отложите 10 микролитров осветленного экстракта для определения общей концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами и немедленно разведите образец до пяти или 10 миллиграммов белка на миллилитр ледяного 1X лизисного буфера на льду.Для иммунопреципитации интересующего белка сначала ресуспендируют магнитные шарики путем инверсии и переносят 150 микролитров суспензии гранул 50X в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Примагнитите бусины на льду к магнитной подставке примерно на одну минуту. Когда раствор станет прозрачным, выбросьте надосадочную жидкость.Снимите трубку с магнитной подставки и промойте шарики тремя 300 микролитровыми объемами 1X буфера для лизиса. После последней промывки повторно суспендируйте шарики в 150 микролитрах ледяного буфера для лизиса и перенесите 75 микролитров суспензии гранул в два миллиграмма образца белкового экстракта. После часовой инкубации при температуре четыре градуса Цельсия при слабом перемешивании поместите пробирку с образцом в магнит на льду примерно на одну минуту.Когда шарики полностью намагничиваются и образец становится прозрачным, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, не потревожив бусины. Отложите 10% образца для вестерн-блоттинга и добавьте 20 микрограммов аффинно очищенного антитела к предварительно очищенному лизату для часовой инкубации при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием. В конце инкубации добавьте оставшиеся 75 микролитров предварительно промытой суспензии гранул в смесь лизата антител для дополнительной одночасовой инкубации при четырех градусах Цельсия при слабом перемешивании.В конце инкубации поместите образец обратно на магнит примерно на одну минуту. Когда шарики полностью намагничиваются и образец становится прозрачным, промойте шарики, содержащие иммунопреципитат, три раза в 450 микролитрах буфера для промывки на льду. После последней промывки повторно суспендируйте гранулу гранул в 20 микролитрах 2X SDS буфера для загрузки геля бета-меркаптоэтанола и кипятите образец при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.Для детектирования иммунопреципитированных белков методом вестерн-блоттинга необходимо загрузить образец денатурированного белка в гель SDS-PAGE без переноса гранул и провести вестерн-блоттинг в соответствии со стандартными протоколами с использованием соответствующих антител к интересующим белкам, затем обнаружить полосы с помощью хемилюминесценции на основе пероксидазы хрена. Продемонстрированный протокол гомогенизатора бисерной мельницы сопоставим по экстракции общего белка с методами на основе даунса для эффективной экстракции ядерных и цитоплазматических белков. В этом анализе было установлено, что белки аргонавты взаимодействуют с членами семейства белков GW182, образуя микроРНК-индуцированные комплексы сайленсинга, которые связываются с целевыми матричными РНК и подавляют их экспрессию.Продемонстрированные протоколы экстракта и иммунопреципитации также могут быть использованы для успешного восстановления специфических со-иммунопреципитатов ALG-1 и HRPK-1. Кроме того, тестирование взаимодействия ALG-1:AIN-1 в различных генетических условиях показало, что HRPK-1 не является необходимым для сборки комплекса сайленсинга, индуцированного микроРНК ALG-1:AIN-1. Важно убедиться, что экстракция белка и иммунопреципитация выполняются при четырех градусах Цельсия или на льду для поддержания стабильности образцов.Этот препарат экстракта общего белка совместим с экспериментами по иммунопреципитации белка и извлечению микроРНК с использованием комплементарного олигонуклеотида микроРНК и облегчает последующий сбор компонентов белка и РНК.

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Биология развития

В этой статье мы описываем оптимизированные процедуры для извлечения и анализа простагландинов и других эйкозаноидов...

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Мы описываем здесь протокол для очистки и характеристики растений белковых комплексов. Показано, что по иммунопреципитации один белок в комплексе, поэтому мы можем определить свои пост-трансляционные модификации и ее взаимодействующих партнеров.

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) и приготовлению белковых экстрактов, которые могут быть использованы в протеомических применениях ниже по течению, таких как масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS ).

Среднесрочная подготовка<em&gt; Drosophila</em&gt; Экстракты эмбрионов для протеомических экспериментов

Цель метода, представленные здесь заключается в изучении агрегации белков во время нормального старения в организме модель C. elegans. Протокол представляет собой мощный инструмент для изучения весьма нерастворимых большие компоситы, которые формируют с возрастом и определить, как изменения в proteostasis воздействия агрегации белков.

Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

Здесь мы представляем собой протокол для изоляции РНК, ДНК и белка из того же образца, в попытке уменьшить вариации, улучшить воспроизводимость и облегчения толкования.

Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в Caenorhabditis elegans

В этой статье представлены методы генерации, очистки и количественной оценки Caenorhabditis elegans внеклеточных пузырьков.

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

In vivo быстрое фотохимическое окисление белков (IV-FPOP) является гидроксиль радикальным протеином, который позволяет картировать структуру белка в их родной среде. Этот протокол описывает сборку и настройку системы микрофлюидирования IV-FPOP.

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Здесь представлено описание простого и относительно быстрого выделения геномной ДНК Caenorhabditis elegans от одного или нескольких животных с использованием коммерчески доступного набора тканей. Полученный препарат гДНК является подходящим шаблоном для ПЦР.

Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans

В этом протоколе описывается РНК-интерференция и анализ ChIP для изучения эпигенетического наследования РНК-индуцированного сайленсинга и связанных с ним модификаций хроматина у C. elegans.

Анализ трансгенерационного эпигенетического наследования C. elegans с использованием флуоресцентного репортера и хроматиновой иммунопреципитации (ChIP)

Этот протокол описывает быстрый, воспроизводимый метод экстракции и осадки на основе органических растворителей для очистки эластиноподобного полипептида (ELP) от Escherichia coli, предоставляя потенциально масштабируемую альтернативу традиционным методам очистки ELP.

Эффективная очистка эластиновых полипептидов (ELP) из E. coli с использованием метода экстракции и осадки на основе органических растворителей

Узнайте метод приготовления экстракта белка и ко-иммунопреципитации из Caenorhabditis elegans. Этот протокол позволяет исследовать взаимодействия белков в различных генетических фонах.

Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Больше видео