Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Этот протокол предусматривает пошаговую процедуру сбора образца, приготовления экстракта и иммунопреципитации для подтверждения успешного вытягивания белка и обнаружения представляющих интерес ко-иммунопреципитированных белков. Приготовление белкового экстракта может быть выполнено на 24 образцах и совместимо с рядом последующих применений, включая эксперименты по иммунопреципитации и извлечению РНК. Этот метод может быть адаптирован для облегчения тестирования взаимодействий между двумя или более эндогенными, эндогенно мечеными или сверхэкспрессированными белками C.elegans в различных генетических фонах.

Визуальная демонстрация этого протокола предназначена для того, чтобы исследователи чувствовали себя комфортно при приготовлении белкового экстракта и иммунопреципитации, в надежде побудить новичков использовать их в своих исследованиях. Чтобы собрать образец червя, сначала засемените смешанную стадию или синхронизируйте червей на твердых пластинах питательной среды для нематод при необходимой температуре и дайте червям вырасти до нужной стадии. В конце инкубации используйте буфер M9, чтобы промыть червей в коническую трубку объемом 15 миллилитров и гранулировать червей путем центрифугирования.

В конце центрифугирования удалите надосадочную жидкость и промойте червей еще три-пять раз в свежем буфере M9 за одну промывку. Когда надосадочная жидкость перестанет мутнеть, проведите одну последнюю промывку двойной дистиллированной водой и переложите рассыпчатую гранулу червя в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Гранулируйте червей с помощью дополнительного центрифугирования и выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость для получения упакованной гранулы червя.

Чтобы приготовить вытяжку из собранной гранулы червя, добавьте равный объем ледяного буфера для лизиса 2X к рекомендуемому объему гранулы объемом 300 микролитров и энергично перемешайте полученную суспензию. Поверните образец вниз, чтобы собрать смесь на дне пробирки, и перенесите содержимое пробирки в 1,5-миллилитровую пробирку без РНКазы, содержащую металлические шарики. Плотно закупорив пробирку, поместите образец в гомогенизатор бисерной мельницы при температуре четыре градуса Цельсия, следя за тем, чтобы образец был сбалансирован внутри гомогенизатора.

Гомогенизируйте образец на максимальной скорости в течение четырех минут перед переносом образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра без гранул. Открутите образец для осветления белкового экстракта и перенесите надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую пробирку на льду, не перенося белый мутный осадок в верхней части образца. Отложите 10 микролитров осветленного экстракта для определения общей концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами и немедленно разведите образец до пяти или 10 миллиграммов белка на миллилитр ледяного 1X лизисного буфера на льду.

Для иммунопреципитации интересующего белка сначала ресуспендируют магнитные шарики путем инверсии и переносят 150 микролитров суспензии гранул 50X в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Примагнитите бусины на льду к магнитной подставке примерно на одну минуту. Когда раствор станет прозрачным, выбросьте надосадочную жидкость.

Снимите трубку с магнитной подставки и промойте шарики тремя 300 микролитровыми объемами 1X буфера для лизиса. После последней промывки повторно суспендируйте шарики в 150 микролитрах ледяного буфера для лизиса и перенесите 75 микролитров суспензии гранул в два миллиграмма образца белкового экстракта. После часовой инкубации при температуре четыре градуса Цельсия при слабом перемешивании поместите пробирку с образцом в магнит на льду примерно на одну минуту.

Когда шарики полностью намагничиваются и образец становится прозрачным, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, не потревожив бусины. Отложите 10% образца для вестерн-блоттинга и добавьте 20 микрограммов аффинно очищенного антитела к предварительно очищенному лизату для часовой инкубации при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием. В конце инкубации добавьте оставшиеся 75 микролитров предварительно промытой суспензии гранул в смесь лизата антител для дополнительной одночасовой инкубации при четырех градусах Цельсия при слабом перемешивании.

В конце инкубации поместите образец обратно на магнит примерно на одну минуту. Когда шарики полностью намагничиваются и образец становится прозрачным, промойте шарики, содержащие иммунопреципитат, три раза в 450 микролитрах буфера для промывки на льду. После последней промывки повторно суспендируйте гранулу гранул в 20 микролитрах 2X SDS буфера для загрузки геля бета-меркаптоэтанола и кипятите образец при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Для детектирования иммунопреципитированных белков методом вестерн-блоттинга необходимо загрузить образец денатурированного белка в гель SDS-PAGE без переноса гранул и провести вестерн-блоттинг в соответствии со стандартными протоколами с использованием соответствующих антител к интересующим белкам, затем обнаружить полосы с помощью хемилюминесценции на основе пероксидазы хрена. Продемонстрированный протокол гомогенизатора бисерной мельницы сопоставим по экстракции общего белка с методами на основе даунса для эффективной экстракции ядерных и цитоплазматических белков. В этом анализе было установлено, что белки аргонавты взаимодействуют с членами семейства белков GW182, образуя микроРНК-индуцированные комплексы сайленсинга, которые связываются с целевыми матричными РНК и подавляют их экспрессию.

Продемонстрированные протоколы экстракта и иммунопреципитации также могут быть использованы для успешного восстановления специфических со-иммунопреципитатов ALG-1 и HRPK-1. Кроме того, тестирование взаимодействия ALG-1:AIN-1 в различных генетических условиях показало, что HRPK-1 не является необходимым для сборки комплекса сайленсинга, индуцированного микроРНК ALG-1:AIN-1. Важно убедиться, что экстракция белка и иммунопреципитация выполняются при четырех градусах Цельсия или на льду для поддержания стабильности образцов.

Этот препарат экстракта общего белка совместим с экспериментами по иммунопреципитации белка и извлечению микроРНК с использованием комплементарного олигонуклеотида микроРНК и облегчает последующий сбор компонентов белка и РНК.