Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo
9 июня 2020 г.
Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.
Этот протокол описывает благородный и простой метод для создания сетчатой формы инженерии сердечных тканей, полученных из человеческих индуцированных частей тела и STEM клеток, полученных сердечных клеток. Гибкость геометрии тканей и масштабируемость функции сохранившихся тканей являются основными преимуществами этой техники. Имплантированная форма сетки ECTs может восстановить сердечную структуру и функцию в модели инфаркта миокарда крысы.
Подтверждение его осуществимости для использования в сердечной регенеративной терапии. Эти методы требуют воспроизводимой обработки стволовых клеток человека и навыков культуры тканей для последовательных результатов. Начните с резки вылеченного листа PDMS до соответствующего размера, чтобы позволить листу быть связаны с силиконовым клеем, чтобы изготовить 21 на 20,5 миллиметр прямоугольный лоток с семи миллиметров длиной 0,5 миллиметра в ширину и 2,5 миллиметра высоких прямоугольных столбов в шахматном положении.
Горизонтальное расстояние между двумя линиями столбов должно быть 2,5 миллиметра. Автоклав лоток при 120 градусах по Цельсию в течение 20 минут, прежде чем покрытие формы с 1%Poloxamer 407 в PBS в течение одного часа. Затем тщательно промыть плесень с PBS и поместить плесень в один колодец из шести хорошо пластины.
Для анализа линии, объединить клетки из кардиомиоцитов плюс эндотелиальных и сосудистых протоколов фрески клеток. Так что окончательная концентрация фресок составляет от 10 до 20% в общей численности клеток от шести раз от 10 до шести ячеек на конструкцию. Смешайте 133 микролитров растворимого растворимого раствора крысиного хвоста и 17 микролитров Alkali Buffer до 17 микролитров 10X Minimum Essential Medium на льду.
Затем добавьте 67 микролитров мембранной матрицы подвала в раствор коллагена. Далее, центрифуга клеток и повторно гранулы в 167 микролитров высокой глюкозы Dulbecco минимальная основная среда дополнена фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков. Смешайте клетки на матричном растворе на льду.
Затем тщательно залить 400 микролитров клеточной матричной подвески на poloxamer 407 покрытием PDMS ткани плесени. Инкубировать смесь матрицы клеток в стандартном инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение 60 минут. Когда ткань сформировалась, тщательно замочите плесень с четырьмя миллилитров ЭСТ культуры среды и вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 14 дней.
Перед имплантацией ЭСТ вы стерилизовали тонкие типсы, чтобы тщательно удалить ЭСТ с погрузочных столбов. Ткань формы могут быть изготовлены с различными шаблонами, после длины и после интервала для создания различных окончательных геометрий ЭСТ. Для этого анализа была использована форма с семимиллиметровыми столбами с интервалом в 2,5 миллиметра.
Poloxamer 407 предотвращает присаделение клеток в форму и позволяет сформировать характерную структуру сетки, после быстрого уплотнения геля в течение 14 дней. Структура поддерживается даже после того, как ЭСТ высвобождается из формы. Конструкция изготовленной ткани имеет ширину около 1,5 см и толщину 0,5 миллиметра.
А ширина каждого пучка в сетке составляет в среднем около 0,5 миллиметра. Можно создать 3 сантиметра окончательной ширины сетки ЭСТ, содержащей 24 миллионов клеток из четырех раз больше плесени с той же шахматной конструкции поста. Эта большая сетка ЭСТ также может быть легко удалена из формы и генерирует локальный акт силы, эквивалентный меньшей сетке ЭСТ.
Важно, чтобы залить смесь матрицы клеток равномерно в форму ткани без генерации пузырьков, чтобы предотвратить чувство дефектов в окончательном гель. Функциональная характеристика подрядчика. и четвертой частоты отношения могут быть выполнены с помощью встроенных систем.
Нашей конечной целью является перевод парадигм ЭСТ в клиническую терапию, в которой используются крупные доклинические исследования на животных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается новый и простой метод создания сетчатых инженерных тканей сердца, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Эта методика позволяет исследовать терапию имплантации клеток при заболеваниях сердца, в частности, на модели инфаркта миокарда у крыс.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Инженерия сердечной ткани
- Терапия стволовыми клетками
- Регенеративная медицина
Теоретические основы
- Инженерные ткани сердца способны восстанавливать структуру и функцию сердечной мышцы.
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека являются ценным ресурсом для получения кардиальных клеток.
- Гибкость геометрии ткани имеет решающее значение для эффективной имплантации.
- Воспроизводимость процессов обработки стволовых клеток необходима для получения стабильных результатов.
Цель исследования
- Разработать метод создания сетчатых инженерных сердечных тканей.
- Оценить возможность применения этих тканей в регенеративной терапии сердца.
- Исследовать восстановление сердечной функции после имплантации.
Используемые методы
- Изготовление прямоугольного лотка с использованием PDMS и силиконового адгезива.
- Создание опорных столбиков для поддержки инженерных тканей.
- Имплантация инженерных тканей сердца в модель крысы.
- Оценка восстановления структуры и функции сердца.
Основные результаты
- Сетчатые инженерные ткани сердца успешно восстановили сердечную функцию.
- Метод продемонстрировал масштабируемость и гибкость в отношении геометрии тканей.
- Стабильные результаты были достигнуты благодаря воспроизводимой обработке стволовых клеток.
- Данный метод может быть применен в регенеративной терапии сердца.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод создания инженерных тканей сердца.
- Ткани в форме сетки могут эффективно восстанавливать функцию сердца в модели инфаркта миокарда.
- Этот подход является перспективным для будущих методов регенеративной терапии сердца.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет осуществлять масштабируемое производство сетчатых инженерных тканей сердца из сердечно-сосудистых клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) человека, предоставляя воспроизводимую платформу для стратегий восстановления миокарда. Этот подход поддерживает доклиническую оценку интеграции тканей и функционального восстановления в моделях ишемического повреждения, восполняя критический пробел в регенеративной кардиологии. Обеспечивая создание геометрически настраиваемой и масштабируемой конструкции, данный метод способствует снижению трансляционных рисков при применении терапии на основе стволовых клеток для лечения сердечной недостаточности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем оценки структурной и функциональной интеграции кардиальных клеток, полученных из hiPSC, in vivo.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый формат ткани для получения согласованных результатов доклинических исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные структурные показатели (например, выравнивание пучков миофибров, синхронность сокращения) для разработки функциональных анализов.
- Практическая ценность: поддерживает масштабирование до более крупных конструктов (до 3.0 cm), что позволяет проводить тестирование зависимости «доза-эффект» и проверку однородности серий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует возможность восстановления структуры и функции сердца на модели инфаркта миокарда у крыс, что способствует снижению механистических рисков.
- Практическая ценность: обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации посредством стандартизированных рабочих процессов имплантации и функциональной оценки.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод позиционирует сетчатые ECT как связующее звено между этапами первичного поиска и доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы на ранних стадиях поиска и проводить функциональную валидацию на доклинических этапах за счет масштабируемого и воспроизводимого производства тканей.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков, обеспечивая контролируемую оценку интеграции и электромеханической функции кардиальных клеток, полученных из hiPSC.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные ткани, готовые к анализу, с количественными показателями (синхронность сокращений, ориентация), что позволяет сравнивать действие различных соединений или условий.
- Аналитика: обеспечивает структурные и функциональные показатели (размеры конструкции, диаметр миофибрилл, синхронность сокращений) для проведения сравнительного анализа между экспериментальными группами.
- Трансляционные исследования: обеспечивает непрерывность процесса от созревания in vitro до восстановления функции in vivo, поддерживая принятие обоснованных решений о продвижении проекта с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: создает платформенную технологию, адаптируемую к различным геометриям и масштабам, что способствует воспроизводимости между проектами и эффективности использования ресурсов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов за счет устранения механистической неопределенности в процессах приживления стволовых клеток и их функционального вклада в восстановление сердечной мышцы.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и масштабируемость благодаря четко определенным соотношениям клеток, составу матрицы и геометрии формы.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения воспроизводимых данных о доклинической эффективности, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов для регенерации миокарда с учетом рисков на основе валидированных показателей функционирования ткани и возможности масштабирования.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дифференцировке человеческих иПСК, спецификации сердечно-сосудистой линии и методах трехмерного культивирования тканей.
- Зависимость от доступа к оборудованию для формовки из ПДМС, возможностям стерилизации и точному дозированию жидкостей для смешивания матрицы с клетками.
- Необходима межкомандная стандартизация источников клеток, подготовки матрицы и протоколов инкубации для обеспечения воспроизводимости от партии к партии.
- Требуется учет особенностей адаптации при масштабировании до более крупных конструкций или изменении геометрии, особенно в отношении диффузии питательных веществ и электрического сопряжения.
- Ограничение текущей зависимости от моделей на грызунах для функциональной валидации, что требует использования более крупных доклинических систем для клинического внедрения.
