6,345 Views
•
11:20 min
•
May 12, 2020
DOI:
Этот протокол облегчает подготовку и администрирование вирусного и фагового коктейля против псевдомонас аэругиноза в эмбрионах зебры. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет in vivo оценки эффективности фагов в противодействии бактериальной инфекции. Фаг коктейль эффективен как в диком типе и муковисцидоз зебры модели.
Открытие возможности применения фаговой терапии к бактериальным инфекциям у больных муковисцидозом. Фаг-терапия также может быть применена для противодействия конкретным бактериальным инфекциям в других модельных системах. Подготовить фаговой запас к эксперименту.
Добавить 1,25 раза 10 до седьмого фагов в OD 600 из 0,05 P.aeruginosa культуры к множественности инфекции один раз от 10 до отрицательного три и инкубировать культуру в течение трех-четырех часов с встряхивания до OD 600 падает до 0,1 до 0,3. В конце инкубации инкубировать лизат с одним микрограммом на миллилитр ДНК и РНКзы в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. И гранулировать клетки центрифугой.
В конце центрифугации фильтр супернатант через 0,8 микрометра поры диаметром и добавить 58 граммов на литр хлорида натрия и 105 граммов на литр PEG 6000. Инкубировать раствор при четырех градусах по Цельсию за одну ночь. На следующее утро, осадки фага центрифугации.
В конце центрофугации удалить супернатант и тщательно растворить фаг гранулы в 15 миллилитров Tris хлорида натрия буфера. Чтобы очистить фаги градиентом плотности хлорида цезия, сначала расслоить два миллилитра из четырех различных растворов хлорида цезия в полиалломерных ультрацентрифугных трубках для SW 41 Rotor и добавить 3,5 миллилитров фаговой суспензии к каждой трубке. Хлорид цезия токсичен.
Всегда при принятии надлежащих процедур безопасности при обработке и отбрасывая это соединение. Когда все трубы были загружены, поместите трубки в ротор, заботясь о том, чтобы трубы были сбалансированы. И центрифугировать образцы в течение двух часов при 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
В конце центрифуги используйте шприц с иглой 19 калибра, чтобы аспирировать белый слой между D равен 1,5, а D равен 1,4 области плотности. И перенесите подвески в новые полиалломеры размером с SW 60. Центрифуга подвески, по крайней мере 16 часов при 150000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
И перенесите видимые полосы в диализные трубки с отрезанием Далтона на 6000. Затем диализа собранные образцы два раза против 500 миллилитров воды в течение 20 минут на диализ и на ночь против 500 миллилитров tris хлоридного хлорида буфера. На следующее утро, фильтр в результате фаг запас с 0,22 микрометр поры фильтра и хранить акции на четыре градуса по Цельсию.
В день микро-инъекции разбавить два одного микромолара морфолиноса фондовых растворов в стерильной воде до окончательной концентрации 0,25 пикомоляр на эмбрион, чтобы получить пять микролитер морфолино инъекционный раствор. И добавить 0,5 микролитров фенола красный к каждому раствору. Далее используйте 20 микролитер микропипет с тонкой гель загрузки отзыв для загрузки микро инъекции иглы со всем объемом морфолино смешанного раствора и обеспечить иглу микро манипулятор подключен к стенду под стерео микроскопом.
Затем с одной или двумя клетками, эмбрионы рыб зебры расположены на стеклянной горке, помещенной в пределах 96 миллиметров в диаметре чашки Петри, проникают в хорион и желток с микроинкурсной иглой и вводят два нанолитров смеси морфлино в эмбрион. В 26 часов после оплодотворения загрузите микроинъемку иглы примерно пятью микролитровами инокулы P.aeruginosa и вставьте иглу dorsally к отправной точке протока Кювье, при котором проток начинает распространяться по желтковому мешку. Ввимите в эмбрион от одного до трех нанолитров инокулятора PAO1, чтобы убедиться, что объем расширяется непосредственно в пределах протока и попадает в кровообращение.
После инъекции перенесите эмбрион в одно из двух новых блюд Петри, содержащих свежие E3 среднего дополняется фенилтируреа в течение 30 минут или трех часов инкубации при 28 градусов по Цельсию. Затем загрузите микроинъемную иглу примерно пятью микролитровами фагового коктейля и зафиксните иглу к микроинжектору. Затем ввините от одного до трех нанолитров фагового коктейля в проток Кювье каждого эмбриона, ранее введенного с бактериями, и поместите эмбрионы в одну из двух новых чашек Петри, содержащих свежие E3 средние, дополненные фенилтиреей при 28 градусах по Цельсию.
В течение четырех часов после заражения используйте пластиковую пипету для переноса обезболивающего эмбриона в стеклянную нижнюю тарелку. И заполнить блюдо с теплой низкой точки плавления агарозы раствора. Когда агароза холодная, аккуратно заполните блюдо средой Е3, дополненной анестетической раствором.
Поместите блюдо под стерео микроскоп и используйте наконечник пипетки, чтобы распоидать эмбрион в нужной ориентации. Затем поместите блюдо под флуоресцентный стерео микроскоп с флуоресцентным фильтром для положительных бактерий GFP на срок до 18 часов после заражения и изображение эмбриона для прогрессирования экспрессии GFP в девять, 14 и 18 часов после заражения. Чтобы определить бактериальную нагрузку на восемь часов после заражения, перенесите 15 анестезированной микро-инъекционных эмбрионов в 1,5 миллилитр центрифуг трубки и заменить обезболивающее решение с 300 микролитров 1%Triton X-100 в PBS.
Пройдите иглы через стерильную 27 калибровочных игл инсулинового шприца по крайней мере 15 раз, чтобы гомогенизировать эмбрионы. И подготовить серийные разбавления гомогената путем передачи 100 микролитров полученной смеси в 900 микролитров стерильных PBS на разбавление. Чтобы выбрать для естественно ампициллина устойчивый штамм P.aeruginosa, пластины 10 микролитров разбавления на LB агар дополняется ампициллин и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день подсчитайте количество колоний. Разрешить расчет общего количества колоний, образующих единицы, и среднего количества колоний, образующих единицы на зараженный эмбрион. Для оценки летальности инфекции P.aeruginosa оценка инъекционных эмбрионов в 20 часов после заражения под стерео микроскопом, подсчитав количество мертвых белых непрозрачных эмбрионов.
Затем рассчитать половину максимальной смертельной концентрации 50 дозы P.aeruginosa, что привело к смерти 50% инъекционных эмбрионов в 20 часов после заражения. Для проверки фенотипа муковисцидоза можно оценить нарушение положения внутренних органов, таких как печень сердца и поджелудочная железа. Бактериальная нагрузка уменьшается с помощью фагоевой терапии эмбрионов муковисцидоза, инфицированных P.Aeruginosa.
В 48 часов после оплодотворения муковисцидоз эмбрионов, инфицированных GFP положительные бактерии P.Aeroginosa 30 колоний формирования единиц на дозу эмбриона демонстрирует 50% летальности в 20 часов после заражения. Фаг-терапия одинаково эффективна в 20 часов после инфицирования при доставке через 30 минут или семь часов после бактериальной инъекции. Здесь показан муковисцидоз и GFP положительный P.Aeruginosa инъекционных эмбрионов в четыре, девять, 14 и 18 часов после заражения показано.
В отличие от муковисцидоза плюс P.Aeruginosa плюс фаг вводили эмбрион демонстрирует снижение флуоресценции из-за фагов действий против бактерий. Воспалительные реакции, порожденные инфекцией P.aeruginosa в муковисцидоз эмбрионов значительно увеличивается, как показано на экспрессии провоспалительных цитокинов, TNF альфа и интерлейкин 1 бета после инъекции P.aeruginosa по сравнению с контролем вводили зебры. Выражение обоих воспалительных цитокинов уменьшается в фаг коктейль совместно вводили животных однако.
Фаге должны быть тщательно очищены, чтобы удалить любой загрязняющий эндотоксин, который может быть сохранен во время подготовки. Фаг препараты могут быть проанализированы с помощью электронной микроскопии для оценки морфологии вириона. Было бы интересно проверить, является ли инфекция у пациентов с человеком бактериями, кроме pseudomonas aeruginosa можно вылечить с фаговой терапии в муковисцидоз зебры модели.
Представлено здесь протокол для Pseudomonas aeruginosa инфекции и фаг терапии применения в муковисцидоз (CF) эмбрионов зебры.
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).
Copy