2D-HELS MS SEQ: Общий метод на основе LC-MS для прямого и de novo секвенирования смесей РНК с различными модификациями нуклеотидов
10 июля 2020 г.
В данной статье мы описываем подробный протокол метода секвенирования на основе LC-MS, который может быть использован как прямой метод для секвенирования короткой РНК (<35 nt на прогон) без промежуточного продукта кДНК, так и в качестве общего метода для секвенирования различных модификаций нуклеотидов в одном исследовании с точностью до одного основания.
Этот протокол охватывает все основные шаги, необходимые при использовании нового метода, разработанного для прямого секвенирования РНК, независимо от того, является ли образец РНК одноцепочечным, смешанным или модифицированным. На метод не влияет ферментативная ошибка или комплементарность оснований. Он обеспечивает прямой рабочий процесс и общее решение, которое позволяет секвенировать различные модификации РНК одновременно, а не одну конкретную модификацию за раз.
Эта технология может быть превращена в диагностический инструмент для определения сигнатурных сегментов РНК, чтобы связать их с заболеванием человека, и точный инструмент для изучения модификаций РНК на эпитранскриптомном уровне. Этот метод не опирается ни на один из предыдущих методов секвенирования. Напротив, это совершенно новый подход, и мы стремимся сделать его основным методом для секвенирования любой модифицированной РНК.
Некоторые части этого протокола содержат критически важные аспекты, которые могут быть более точно переданы с помощью визуальной демонстрации, такие как маркировка 3'-конца сбора данных РНК LC-MS и анализ данных с помощью программного обеспечения MassHunter. Я продемонстрирую эту процедуру, настрою LC-MS и измерю наши образцы РНК. Чтобы провести одностадийную реакцию мечения, соедините 2 микролитра 150 микромолярного AppCp-биотина, 3 микролитра 10-кратного реакционного буфера лигазы, 1,5 микролитра образца 100 микромольной РНК, 3 микролитра безводного ДМСО, 10 единиц Т4-РНК-лигазы и 19,5 микролитров воды, обработанной DEPC, общий объем 30 микролитров.
Инкубируйте реакцию в течение ночи при температуре 16 градусов Цельсия, затем проведите очистку колонки в соответствии с указаниями рукописи. Разделив РНК на три аликвоты и добавив равный объем муравьиной кислоты, инкубируйте реакции при температуре 40 градусов Цельсия. После завершения каждой реакции немедленно заморозьте образец на сухом льду, чтобы погасить разложение кислоты.
Используйте центробежный вакуумный концентратор для сушки образца в течение примерно 30 минут. Суспендируйте высушенные образцы в 20 микролитрах воды, обработанной DEPC, и соедините их. Храните образцы при температуре 20 градусов Цельсия до измерения LC-MS.
Перенесите образец РНК во флакон с образцом LC-MS после подготовки подвижных фаз. Каждая инъекция должна содержать от 100 до 400 пикомолов РНК и 20 микролитров. После получения данных используйте рабочий процесс извлечения молекулярных признаков для извлечения информации о соединениях, включая массу, время удержания, объем и показатель качества.
Используйте формат данных центроида в настройках малых молекул. Установите пиковую высоту не менее 100, но меньше 1 000, а показатель качества — не менее 50. Наконец, экспортируйте данные в виде файла Excel.
Отделение 3'-лестницы от 5'-лестницы и других нежелательных фрагментов показано здесь на 2D-графике времени удержания массы. Также возможно секвенирование смешанных образцов, содержащих две нити РНК разной длины с меткой 5'биотина на каждой РНК. Чтобы дифференцировать уридин от псевдоуридина, РНК обрабатывали КМЦ, который превращает псевдоуридин в аддукт КМЦ-псевдоуридина.
Аддукт имеет различную массу в уридине и может быть дифференцирован в 2D-HELS MS Seq. Для расчета процента конверсии использовали профиль ВЭЖХ сырого продукта реакции превращения псевдоуридина в его CMC-аддукт, который составил 42%. Смесь пяти различных цепей РНК секвенировали с помощью подхода 2D-HELS MS Seq с 3'-концевой маркировкой и нормализовали для лучшей визуализации множественных последовательностей РНК. Без нормализации буквенные коды последовательностей пяти РНК были бы скучены друг к другу.
Пытаясь выполнить эту процедуру, тщательно настраивайте реакцию мечения, чтобы получить высокий выход меченых образцов РНК. Также внимательно следите за временем разложения, чтобы создать надежные массовые лестницы и собрать максимальное количество высушенных образцов с 20 микролитрами воды. Вопрос, который можно задать после выполнения этого протокола, заключается в том, как увеличить ширину, длину и пропускную способность метода секвенирования.
В этом может помочь более совершенный алгоритм и более совершенный инструмент с более высоким разрешением и чувствительностью. После разработки этого протокола стало возможным прямое секвенирование более широкого спектра образцов РНК, содержащих как канонические, так и модифицированные нуклеотиды, без каких-либо ошибок, связанных с секвенированием РНК на основе CDA.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод секвенирования коротких РНК на основе ЖХ-МС, который устраняет необходимость в промежуточном синтезе кДНК. Данный протокол позволяет осуществлять одновременное секвенирование различных модификаций РНК с однонуклеотидной точностью.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Секвенирование РНК
- Эпитранскриптомика
- Биотехнология
Теоретические сведения
- Современные методы секвенирования РНК часто опираются на промежуточные продукты в виде кДНК.
- Ферментативные ошибки могут влиять на точность секвенирования.
- Одновременное секвенирование модификаций РНК представляет собой сложную задачу.
- Понимание модификаций РНК имеет решающее значение для изучения заболеваний человека.
Цель исследования
- Представить метод прямого секвенирования РНК.
- Обеспечить возможность изучения множественных модификаций РНК в рамках одного анализа.
- Предоставить надежный инструмент для эпитранскриптомных исследований.
Используемые методы
- Метод секвенирования на основе ЖХ-МС.
- Прямое секвенирование одноцепочечной, смешанной или модифицированной РНК.
- Исключение этапа синтеза кДНК.
- Рабочий процесс, разработанный для обеспечения высокой прецизионности и точности.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно секвенировать короткие РНК (<35 nt) без использования кДНК.
- Было достигнуто одновременное обнаружение различных модификаций РНК.
- Метод продемонстрировал устойчивость к ферментативным ошибкам.
- Были определены потенциальные возможности применения метода в диагностике заболеваний человека.
Выводы
- Этот новый метод секвенирования может стать стандартом для анализа модифицированной РНК.
- Он предлагает комплексный подход к изучению модификаций РНК.
- Данный протокол имеет важное значение для будущих исследований в области биологии РНК.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод секвенирования РНК на основе ЖХ-МС позволяет осуществлять прямое секвенирование модифицированных смесей РНК de novo без синтеза кДНК, устраняя одно из основных препятствий в валидации мишеней эпитранскриптомики. Предоставляя количественные данные секвенирования с разрешением по модификациям, этот метод способствует раннему поиску биомаркеров на основе РНК и снижению механистических рисков при разработке терапевтических олигонуклеотидов. Данный подход повышает прогностическую достоверность идентификации ведущих соединений, обеспечивая получение подтвержденных по последовательности и специфичных по модификациям результатов, которые могут быть непосредственно применены в процессах скрининга и разработки аналитических методов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямого секвенирования модификаций РНК, таких как псевдоуридин и 5-метилцитозин, в их нативном контексте.
- Практическая ценность: представляет собой универсальный способ одновременного детектирования канонических и модифицированных нуклеотидов, что снижает необходимость в последовательном проведении специфических анализов на каждую модификацию.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность определения мишеней за счет прямой корреляции времени удерживания массы модифицированных нуклеооснований, что способствует точному картированию сайт-специфических модификаций.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных данных о массе и времени удерживания, что позволяет надежно дифференцировать последовательности РНК в смесях, содержащих до 12 различных олигонуклеотидов.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимые данные, готовые к нормализации и совместимые со стандартными системами ВЭЖХ-МС высокого разрешения, что способствует стандартизации анализа коротких панелей РНК.
- Масштабируемость: облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующего скрининга за счет получения проверенных по последовательности стандартов РНК с определенными паттернами модификаций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает верификацию последовательности модифицированных терапевтических РНК-олигонуклеотидов, связывая модификации на этапе поиска с оценкой доклинических кандидатов.
- Снижение механистических рисков: позволяет обнаруживать сдвиги массы, вызванные модификациями (например, аддукт CMC-псевдоуридина), чтобы отличить истинный сигнал от артефактов деградации в сложных образцах.
- Оптимизация продвижения с учетом рисков: обеспечивает подтверждение последовательности без ферментативного смещения, что снижает количество ложноотрицательных результатов при скрининге модификаций и повышает надежность принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска как инструмент предварительного секвенирования для анализа РНК на основе выдвинутых гипотез, способствуя идентификации перспективных соединений путем подтверждения последовательности и статуса модификации синтетических или эндогенных мишеней РНК перед функциональным скринингом.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей метаболизма, предоставляя прямые доказательства совместного присутствия последовательности РНК и ее модификаций в нативных или синтетических смесях.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа путем создания лестниц времени удерживания и массы, которые служат количественными эталонами для профилирования деградации или модификаций РНК, индуцированных соединениями.
- Аналитика: генерирует данные о молекулярных характеристиках на основе центроидов (масса, время удерживания, объем, показатель качества), которые можно экспортировать в Excel для сравнения условий и статистической оценки стабильности модификаций.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность доклинических исследований, предоставляя верифицированные по последовательности стандарты модифицированной РНК, подходящие для сопоставления с биомаркерами и функциональной валидации в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый инструмент на базе LC-MS для быстрого секвенирования коротких вариантов РНК (<35 nt), что снижает зависимость от внешнего секвенирования и ускоряет внутренние циклы скрининга модификаций.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет устранения ошибок, связанных с использованием кДНК, и возможности прямого наблюдения масс-спектрометрических сигнатур конкретных модификаций.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость благодаря стандартизированным этапам маркировки, кислотной остановки реакции и нормализации, которые минимизируют межитерационную вариабельность в сложных смесях РНК.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить внутреннее секвенирование модифицированной РНК, что снижает зависимость от внешних поставщиков и ускоряет циклы итераций при оптимизации ведущих соединений.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков, предоставляя однозначные данные о последовательности и модификациях, что снижает вероятность отсева проектов на поздних стадиях из-за невыявленной гетерогенности РНК или ошибочной аннотации.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с РНК, эксплуатации систем ВЭЖХ-МС и извлечения молекулярных признаков с помощью ПО MassHunter для точной интерпретации данных.
- Необходим доступ к системам ВЭЖХ-МС высокого разрешения, способным осуществлять сбор центроидных данных с заданными порогами высоты пика (100–1000) и показателем качества (≥50).
- Требуется межкомандная стандартизация эффективности мечения, времени деградации и протоколов нормализации для обеспечения единообразного формирования масс-лестниц разными пользователями и на разных платформах.
- При расширении области применения за пределы коротких РНК (<35 nt) или при переходе к сложным биологическим образцам потребуются дополнительные доработки, ожидаемые с будущим совершенствованием алгоритмов и приборов.
- Существуют практические ограничения, включая текущую пропускную способность и зависимость от ручной оптимизации реакций мечения (например, AppCp-biotin, T4 ligase, DMSO) для максимизации выхода и разрешения лестницы.
