Комбинированная анатомическая и функциональная трассировка in vivo вентральных тегментальных клемм глутамата в гиппокампе

В современном протоколе анализируется доступный и простой метод комбинированного нейроанатомического и электрофизиологического отслеживания нейроцепей in vivo. Этот метод позволяет картировать дополнительные терминали из определенной популяции нейронов в целевой участок. Аналогичным образом, анатомическая карта этих окончаний может быть проверена с помощью оптогенетической стимуляции во время внеклеточной записи в целевом участке.

Этот протокол может быть применен для изучения нескольких нейронных цепей, связанных с сенсорными, моторными и когнитивными функциями. Выполнение этой процедуры требует некоторых знаний в области стереотаксической хирургии у грызунов и обращения с деликатными нейронными электродами. Подключение системы записи для предотвращения появления шума в записях.

Визуальная демонстрация освещает основные шаги по созданию доступной светодиодной системы для оптогенетики in vivo. Также в нем показано, как подключить усилитель к светодиодному драйверу для синхронной записи и стимуляции у мыши, находящейся под наркозом. Поместите грелку на стереотаксическую рамку так, чтобы на ней лежало тело мыши, что поможет поддерживать температуру ее тела на протяжении всей процедуры, после чего аккуратно зафиксируйте голову на стереотаксическом аппарате.

Подготовьте операционную область, очистив ее сначала раствором йода, а затем спиртом, чтобы удалить йод. Затем нанесите местный лидокаин для блокировки чувствительности кожи головы. Затем с помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии, идущий от лобной до затылочной области.

Для инъекции в вентральную область покрышки или ВТА расположите шприц с ультратонкой иглой с тупым концом на отрицательном расстоянии 3,08 миллиметра спереди сзади и 0,5 миллиметра медиальной латеральной координаты относительно брегмы. С помощью сверлильного инструмента просверлите отверстие диаметром в один миллиметр в черепе по отмеченной координате. Следуйте инструкциям производителя, чтобы зафиксировать держатель шприца на микроманипуляторе и наполните шприц двойной дистиллированной водой для очистки и проверки потока жидкости.

Затем сдайте воду, чтобы проверить расход шприца. Разморозьте аликвоты аденоассоциированного вируса или коктейля AAV на льду. Наполните установленный шприц 1000 нанолитрами раствора AAV и выдайте 10 нанолитров раствора, чтобы подтвердить расход жидкости.

С помощью микроманипулятора опустите иглу к месту инъекции и введите от 600 до 800 нанолитров AAV в VTA, доставляя раствор со скоростью 60 нанолитров в минуту. Через три недели после инъекции AAV прикрепите голову животного к стереотаксической рамке, как описано ранее, и выполните трепанацию черепа, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку. С помощью сверлильного инструмента удалите часть теменной кости.

Под диссекционным микроскопом используйте изогнутый кончик иглы 27 калибра, чтобы иссечь обнаженную твердую мозговую оболочку, стараясь не раздвинуть нежное покрытие кожуры и кортикальные ткани в этой области. Нанесите капли искусственной спинномозговой жидкости на область трепанации черепа, чтобы предотвратить сухость. Просверлите отверстие в затылочной кости, чтобы удерживать винт заземления, и подсоедините провод заземления из нержавеющей стали.

Перед опусканием канюли подключите оптоволоконный кабель к оптоволоконному светодиодному источнику. Опустите оптическое волокно диаметром 400 микрометров в VTA с координатами AP отрицательные 3,08 миллиметра и ML 0,5 миллиметра. С помощью микроманипулятора расположите контактные участки электродов в пирамидальном слое ячейки CA1.

Чтобы синхронизировать световой импульс с нейронной записью, подключите драйвер светодиода и цифровой импорт контроллера записи к транзисторно-транзисторному логическому генератору с разветвителем BNC. Отрегулируйте ручку, чтобы определить эффективную интенсивность, которая может генерировать отклик без создания фотоэлектрических артефактов, и соедините землю на черепе с землей на адаптере. Подключите головной каскад предусилителя к записывающему контроллеру с помощью последовательного периферийного интерфейсного кабеля и проверьте цветные светодиодные индикаторы на портах записывающего контроллера.

Зеленый и желтый светодиоды указывают на нужное напряжение на подключенной плате усилителя, а красный светодиод указывает на работающее программное обеспечение для управления головным каскадом. После запуска программного обеспечения выберите формат файла данных и измените имя файла. Переключитесь на порт подключенного головного столика и нажмите «Отключить все включенные порты», если у электрода меньше каналов, чем у головного каскада.

Выберите подходящее количество каналов, которые будут отображаться на экране. Чтобы захватить временную метку TTL для синхронизированной нейронной записи и временную метку, запускаемую световым импульсом, нажмите на цифровой импорт и включите цифровой формат в нулевом номере. Это должно соответствовать соединению BNC на цифровом импорте усилителя.

Отрегулируйте шкалу времени и напряжения для отображения соответствующей формы сигнала и выберите частоту дискретизации, помня о том, что более высокая частота дискретизации и количество каналов увеличат размер файла. Затем установите полосу пропускания усилителя для записи одного устройства. Здесь использовалась частота среза от 300 до 5 000 Гц.

Чтобы получить звук спайка, нажмите на аналоговый выход звука и включите аналоговый порт. Затем отрегулируйте усиление и глушитель для оптимального звучания. Чтобы синхронизировать запись усилителя и последовательность световых импульсов, нажмите на вкладку дисплея и включите отображение маркера.

Переключитесь на соответствующий канал, соответствующий соединению BNC, и повторно проверьте порты, чтобы убедиться, что каналы записи и цифровой входной канал включены для захвата нейронных пиков и временных меток световых импульсов. Нажмите на область спайков, чтобы просмотреть формы сигналов, составляющие непрерывно записываемый цепь спайков. С помощью мыши можно задать пороговое значение для отображения осциллограмм.

Затем проверьте среднеквадратичное значение, чтобы определить уровень шума в записи. Экспрессия аденоассоциированного вируса была верифицирована с помощью иммунофлуоресцентной визуализации EYFP в вентральной тегментальной области мышей через 21 день после инъекции. Флуоресцентная визуализация также использовалась для обнаружения пресинаптических проекций глутамата VTA в слоях гиппокампа DG, CA3 и CA1.

После того, как была обнаружена внеклеточная активность напряжения, базовая активность регистрировалась в течение примерно 10 минут, прежде чем вызвать световой импульс на желаемой частоте. Это позволило сравнить частоту возбуждения или взрыва предполагаемых нейронов CA1 до и после фотостимуляции глутамата VTA. Чтобы подтвердить этот результат, статистическое сравнение скорости возбуждения сети CA1 до и после фотостимуляции показало значительное увеличение в период после стимуляции.

Последующий анализ растрового цепи для обнаружения всплесков также показал повышенную частоту всплесков для предполагаемых пирамидных нейронов CA1 после фотостимуляции. Реакцию на фотомоделирование идентифицировали по флуоресценции экспрессии репортеров AAV в местах стимула. Также описание должно быть соотнесено с местом записи для отзывчивых предполагаемых единиц.

Этот метод также может быть выполнен на бодрствующих мышах, выполняющих поведенческие задачи. В этом случае следует использовать хронические имплантируемые зонды и волоконно-оптическую канюлю. Этот метод позволит проводить надежное отслеживание нейронных цепей с помощью комбинации распределения пресинаптических окончаний в целевом участке и модуляции пресинаптических окончаний для обнаружения реакции целевого сайта in vivo.