Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток
13 июня 2020 г.
Здесь представлены методы для понимания противораковых эффектов lactobacillus бесклеточного супернатанта (LCFS). Линии клеток колоректального рака показывают гибель клеток при лечении LCFS в 3D-культурах. Процесс генерации сфероидов может быть оптимизирован в зависимости от каркаса, а представленные методы анализа полезны для оценки задействованных сигнальных путей.
Этот протокол был оптимизирован для упрощения исследования противоопухолевого эффекта надосадочной жидкости Lactobacillus в различных типах сфероидов клеток рака толстой кишки. Этот метод является первым подходом, который исследует противораковые эффекты LCFS на сфероиды рака толстой кишки в условиях мимикрии in vivo. Начните с помещения стерилизованной агаровой пластины MRS в водородную анаэробную камеру при температуре 37 градусов Цельсия с содержанием кислорода 20 частей на миллион и загрузите пластину свежеразмороженным бактериальным запасом Lactobacillus.
Добавьте в трубку два-три миллилитра бульона MRS, дополненного L-цистеином, и запечатайте трубку пробкой из бутилкаучука и крышкой трубки. Затем с помощью петли соберите одну колонию и поместите колонию в культуральную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров PBS. Повторно равномерно суспендируйте колонию в физиологическом растворе и загрузите всю бактериальную суспензию в одномиллилитровый шприц.
Вставьте иглу в центр крышки пробирки для культуры и введите колонию в среду. Поместите культуру в встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и 200 оборотах в минуту. Через два дня измерьте OD620 культуры на спектрофотометре.
Когда OD620 равен двум, осадите бактерии центрифугированием и промойте бактериальные гранулы PBS. После второго центрифугирования ресуспендируйте бактерии в четырех миллилитрах RPMI 1640, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой без антибиотиков, и поместите бактерии в встряхивающий инкубатор на четыре часа со скоростью 100 оборотов в минуту. В конце инкубации гранулируйте бактерии методом центрифугирования и стерильно отфильтруйте восстановленную надосадочную жидкость через сетчатое фильтр с плотностью 0,22 микрона для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Чтобы подготовить клеточные линии колоректального рака к образованию сфероидов, культивируйте интересующие клетки в виде монослоев в 100-миллиметровых чашках Петри в инкубаторе для клеточных культур. Когда клетки достигнут конфлюенции от 70 до 80%, промойте культуры два раза четырьмя миллилитрами PBS на промывку, прежде чем отделить клетки одним миллилитром 0,25% трипсина-ЭДТА на чашку. Через две минуты проверьте наличие диссоциации под световым микроскопом.
Если клетки оторвались, нейтрализуйте ферментативную реакцию пятью миллилитрами питательной среды. Соберите клетки центрифугированием в одной конической пробирке объемом 15 миллилитров на каждую клеточную культуру и аккуратно суспендируйте гранулы тремя миллилитрами питательной среды на пробирку. Затем подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью исключения трипанового синего.
После подсчета разбавьте клетки до одного-двух умноженных на 10-пятую концентрацию клеток на миллилитр в свежей среде и добавьте метилцеллюлозу к клеткам до конечной концентрации 0,6%. Перенесите клетки в стерильный резервуар и с помощью многоканальной пипетки выдайте 200 микролитров клеток в каждую лунку 96-луночного микропланшета со сверхнизким уровнем крепления. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 24-36 часов до проверки на образование сфероидов с помощью световой микроскопии.
Для лечения LCFS необходимо последовательно развести приготовленный размороженный стоковый раствор LCFS в свежей питательной среде до концентраций 25, 12,5 и 6% и с помощью пипетки объемом 200 мкл тщательно удалить как можно больше надосадочной жидкости из каждой лунки покрытых культур клеточной линии колоректального рака. Затем аккуратно добавьте 200 микролитров питательной среды с добавлением LCFS в трех экземплярах к каждому набору раковых клеток и верните планшет в инкубатор еще на 24-48 часов. Концентрация метилцеллюлозы 0,6% превращает испытуемые клетки раковой клеточной линии в компактные сфероиды, что указывает на то, что сфероиды могут быть получены из нескольких типов колоректального рака с использованием этого протокола.
Сфероиды, культивируемые с 25% LCFS, демонстрируют разрушенные поверхности и снижение жизнеспособности клеток дозозависимым образом. Действительно, ко-культивируемые клетки LCFS демонстрируют более высокие уровни экспрессии йодида пропидиума по сравнению с жизнеспособными контрольными клетками. Для оценки влияния LCFS на апоптоз раковых клеток также можно проводить ПЦР-анализ с обратной транскриптазой, вестерн-блоттинг и анализ проточного цитометрического аннексина V/7-AAD.
Обязательно обращайтесь с сфероидами осторожно при удалении питательной среды, так как сфероиды могут легко сломаться, что сделает невозможным наблюдение за эффектом обработки LCFS. После этой процедуры можно провести анализ жизнеспособности клеток, количественную ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинг и анализ FACS для более детальной характеристики противоопухолевого эффекта LCFS.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол исследования противоопухолевого действия бесклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS) на сфероиды рака толстой кишки. В работе оптимизируется процесс получения сфероидов и оцениваются сигнальные пути, участвующие в гибели клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические сведения
- Lactobacillus известна своими потенциальными полезными свойствами для здоровья.
- Бесклеточные супернатанты могут содержать биоактивные соединения.
- Колоректальный рак остается серьезной проблемой здравоохранения.
- 3D-культуры клеток лучше имитируют условия in vivo.
Цель исследования
- Изучение противоопухолевого действия LCFS на сфероиды рака толстой кишки.
- Оптимизация методов получения сфероидов.
- Анализ сигнальных путей, участвующих в наблюдаемых эффектах.
Используемые методы
- Приготовление чашек с агаром MRS в анаэробной камере.
- Инокуляция чашек стоковым раствором бактерий Lactobacillus.
- Культивирование бактерий в бульоне MRS с добавлением l-цистеина.
- Сбор и ресуспендирование бактериальных колоний для последующей обработки.
Основные результаты
- Клеточные линии колоректального рака демонстрировали гибель клеток при обработке LCFS.
- Оптимизированные методы получения сфероидов улучшили результаты экспериментов.
- Сигнальные пути, участвующие в гибели клеток, были эффективно проанализированы.
- Данное исследование предлагает новый подход к изучению методов лечения рака.
Выводы
- LCFS проявляет перспективность в качестве потенциального противоопухолевого средства.
- Методы 3D-культивирования необходимы для точного моделирования.
- Требуются дальнейшие исследования для полного понимания задействованных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики оценивать противоопухолевую активность супернатантов, полученных из пробиотиков, на физиологически релевантных 3D-моделях колоректального рака. Использование бесклеточного супернатанта Lactobacillus fermentum (LCFS) в стабильных культурах сфероидов позволяет снизить риски при изучении механизмов действия кандидатов из числа природных соединений и повысить прогностическую достоверность при валидации мишеней. Данный подход связывает скрининг на стадии поиска с трансляционной значимостью за счет моделирования взаимодействий в микроокружении кишечника, влияющих на жизнеспособность раковых клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы о микробных метаболитах и их влиянии на пути гибели клеток колоректального рака.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством дозозависимого анализа жизнеспособности в моделях 3D-сфероидов.
- Прогностическая ценность: Способствует отбору перспективных препаратов в портфеле путем установления связи между апоптозом, индуцированным LCFS, и измеримыми молекулярными маркерами с помощью qRT-PCR, Вестерн-блоттинга и FACS.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений с использованием воспроизводимого формирования сфероидов в планшетах с ультранизкой адгезией.
- Количественные показатели: получение данных зависимости «доза-эффект» (25%, 12,5%, 6% LCFS), позволяющих оценить IC50 и моделировать взаимосвязь «структура-активность».
- Масштабируемость: использование 96-луночного формата, совместимого с автоматизированными системами дозирования жидкостей и высокопроизводительным скринингом жизнеспособности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование патофизиологии колоректального рака с использованием сфероидов из линий клеток пациентов или установленных клеточных линий, которые отражают архитектуру опухоли in vivo.
- Трансляционная преемственность: Связь результатов первичных исследований с доклинической валидацией за счет поддержания согласованных условий 3D-культивирования на всех этапах анализа.
- Принятие решений с учетом рисков: Определение критериев принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе уровней индукции апоптоза и порогов жизнеспособности, наблюдаемых в кокультурах сфероидов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска после идентификации мишени и перед оптимизацией соединений-лидеров, предоставляя релевантную с точки зрения заболевания систему для оценки биоактивных супернатантов микробного происхождения.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о противоопухолевых механизмах микробов и выяснение путей их воздействия в 3D-моделях, которые точнее прогнозируют ответы in vivo.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет использования стандартизированных протоколов формирования сфероидов и обработки LCFS.
- Аналитика: Позволяет проводить количественные измерения зависимых переменных (жизнеспособность, маркеры апоптоза) для статистического сравнения различных условий обработки и клеточных линий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от скрининга на основе сфероидов до доклинической валидации за счет сохранения точности 3D-культивирования.
- Корпоративное повторное использование: Создает многофункциональную платформу для скрининга супернатантов пробиотиков, экстрактов ферментированных продуктов или терапевтических средств на основе микробиома при различных типах рака.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет сокращения числа ложноположительных результатов, характерных для 2D-моделей, и учета эффектов, зависящих от микроокружения.
- Операционная ценность: Стандартизирует процессы создания сфероидов и протоколы их обработки, что повышает воспроизводимость результатов в разных центрах и снижает вариабельность анализа.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски при разработке вмешательств, направленных на микробиом, до проведения дорогостоящих исследований in vivo.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию перспективных соединений природного происхождения с учетом рисков на основе индукции апоптоза и зависимости «доза-ответ» в клинически значимых моделях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с анаэробными культурами бактерий, манипуляций с 3D-сфероидами и методами анализа апоптоза (qPCR, WB, FACS).
- Необходимость в использовании такого оборудования, как анаэробные камеры, встряхивающие инкубаторы, спектрофотометры и проточные цитофлуориметры.
- Необходима стандартизация процессов между группами микробиологии и биологии рака для обеспечения единообразного приготовления LCFS и контроля качества сфероидов.
- Требуется адаптация протокола при расширении исследования на другие бактериальные штаммы или типы рака, помимо моделей колоректального рака.
- Ограничение в связи с хрупкостью сфероидов при замене среды, что требует осторожного обращения для сохранения структурной целостности для получения точных результатов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
